基于DNA條形碼的白斑切葉蜂粉源植物種類及多樣性分析

何 波,谷戰(zhàn)英,李紅英,黃敦元,3,*

1 重慶師范大學,媒介昆蟲重慶市重點實驗室,重慶動物生物學重點實驗室,重慶 401331 2 中南林業(yè)科技大學, 經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室,育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室,長沙 410004 3 中國科學院動物研究所 動物進化和系統(tǒng)學重點實驗室,北京 100101

近年來,由于氣候變化和人為因素的影響,野生蜜蜂面臨多種風險,致使傳粉者的服務(wù)功能在全球許多地區(qū)嚴重下降[1- 5]。鑒于傳粉蜜蜂在經(jīng)濟作物授粉和野生植物繁衍方面的重要性,研究人員逐漸重視并嘗試保護這些野生蜜蜂資源[6- 8]。粉源植物的多樣性和筑巢地點的適應(yīng)性是影響野生蜜蜂物種多樣性最主要的因素[9- 10]。粉源植物多樣性通常使用野外觀察的方法,但具有一定的局限性,例如對觀察的時間和空間具有敏感性,并且在野外觀察條件下傳粉者的種類難以準確鑒別。

孢粉學(Palynology),作為一種基于形態(tài)學鑒定花粉種類的方法,促進了植物與傳粉者相互作用機制方面的研究[11- 13]。但其需要相當?shù)姆诸悓W技巧和經(jīng)驗[14],并且有些植物類群的花粉因缺乏顯著的物種識別特征而難以區(qū)分,如：桔梗科(Campanulaceae)和唇形科(Lamiaceae)[15- 16]。隨著DNA條形碼的發(fā)展,研究人員開始利用該方法來識別蜜蜂蜂糧中含有的植物種類[14, 17- 19]。Hawkins等[20]指出,與孢粉學相比,DNA條形碼可以更精確更迅速地鑒定出蜂糧中的物種組成,且不需要深厚的分類學研究基礎(chǔ)。

白斑切葉蜂(Megachilestrupigera)廣泛分布于中國南方地區(qū),是野生植物及農(nóng)林作物的重要傳粉昆蟲之一[21]。該蜂在江西地區(qū)1年2代,可在蘆葦管制作的人工巢箱內(nèi)進行筑巢,并在其內(nèi)制作蜂糧來繁育后代[22]。本研究使用蘆葦管制作的人工巢管收集白斑切葉蜂,通過分子克隆并結(jié)合DNA條形碼技術(shù)鑒別蜂糧中的物種組成,以揭示不同樣地白斑切葉蜂粉源植物種類及多樣性,為該蜂的保護和可持續(xù)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究樣地概況

本研究在江西省選擇4種不同地貌類型的林地(圖1)。其中,新余市水北鎮(zhèn)(XYSB)和吉安市戈坪鄉(xiāng)(JAGP)地處中亞熱帶地區(qū),年均溫度19.1℃,這兩個樣地均為山地丘陵,森林植被類型以杉木(Cunninghamialanceolata)、濕地松(Pinuselliottii)和油茶(Camelliaoleifera)等人工林為主。贛州市沙地鎮(zhèn)(GZSD),地屬低海拔丘陵,年平均氣溫為19.1℃至20.4℃；該樣地以馬尾松(Pinusmassoniana)為主,林下雜灌密集并零星種植部分幼齡油茶。贛州市齊云山自然保護區(qū)(GZQYS),位于贛州市崇義縣西北邊緣地帶,地處羅霄山脈的南端,年平均氣溫17℃,屬濕潤型季風氣候帶,常年溫暖濕潤,雨量充沛；植被類型以常綠闊葉林為主,部分針葉樹種為輔的混交林。

1.2 樣品采集及DNA提取

根據(jù)白斑切葉蜂2個世代的主要發(fā)生時期(7月上旬和8月中旬),野外收集該蜂的筑巢巢管,并帶回實驗室解剖,置于-30℃下保存?zhèn)溆?圖1)。同時,對4個樣地每個巢箱周圍2 km為半徑范圍內(nèi)[23]的所有開花植物進行采集,共收集到開花植物81種,用于建立專用的植物DNA參考數(shù)據(jù)庫(相關(guān)DNA序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫)。

蜂糧DNA提取前先將每個樣地單個時期采集的蜂糧混合成一個樣本,共得到8份含有花粉混合物的樣本。將每份樣本加入液氮,研磨時充分混勻,取100 mg用于DNA的提取。植物DNA提取使用新鮮葉片100 mg經(jīng)液氮研磨后用于DNA的提取。實驗具體步驟參照QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit中的使用手冊。

1.3 PCR擴增和測序

開花植物和蜂糧分別進行rbcL、trnH-psbA和ITS2基因序列的擴增。rbcL擴增引物為：rbcLa_For(5′-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC- 3′)和rbcLa_Rev(5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG- 3′)；trnH-psbA擴增引物為：psbA3(5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC- 3′)和trnH05(5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC- 3′)；ITS2擴增引物為：ITS2_S2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT- 3′)和ITS2_S3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT- 3′)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：上下游引物各1 μL(10 μmol/L),DNA模板1 μL(50—100 ng),ddH2O 12.75 μL,dNTP 4 μL,10×LA PCR Buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,TaKaRa LA Taq酶(5 U/μL)0.25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s,52℃退火45 s,72℃延伸1 min,共35個循環(huán)；最后72℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增產(chǎn)物送北京中科希林生物有限公司進行純化、克隆及測序。其中,植物葉片擴增產(chǎn)物直接測序,蜂糧擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆后,每個樣本隨機挑選100個單克隆用于測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

序列分析用軟件Clustal W 2.1[24]進行多重序列比對,由Mothur version v.1.30[25]軟件在99 %相似度下進行可操作分類單元(OTU)聚類,隨后將OTU的代表序列與已建立的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫進行比對和分類。最后,統(tǒng)計蜂糧中各樣本在各個分類水平上的植物群落組成及豐度。

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2007進行統(tǒng)計分析,利用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。運用R軟件的spaa包和vagan包計算Shannon-wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)；Mothur軟件計算Chao1指數(shù)。統(tǒng)計圖由Excel 2007和R軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 序列拼接與組裝

白斑切葉蜂在4個樣地的2個主要發(fā)生時期共采集到29個筑巢的巢管,解剖后共獲得124個含有蜂糧的蟲室。從蜂糧的rbcL、trnH-psbA和ITS2基因測序中獲得優(yōu)質(zhì)序列共2400條。在99%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs共120個(表1)。

表1 白斑切葉蜂蜂糧樣品和測序的基本信息

OTU：操作分類單元Operational taxonomic unit；XYSB：新余市水北鎮(zhèn)；JAGP：吉安市戈坪鄉(xiāng)；GZSD：贛州市沙地鎮(zhèn)；GZQYS：贛州市齊云山自然保護區(qū)

2.2 粉源植物DNA條形碼鑒定

白斑切葉蜂蜂糧的OTU代表序列與專用的數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果表明：rbcL序列比對后通常會出現(xiàn)多個一致性高于99%的物種,而無法準確鑒定到種。例如,金毛耳草(Hedyotischrysotricha)和攀莖耳草(Hedyotisscandens)序列的一致性為100%。相反,trnH-psbA和ITS2序列雖然也有少數(shù)物種未被鑒定到種,但其鑒定成功率比rbcl更高。3個基因序列的鑒定準確率為ITS2>trnH-psbA>rbcL。然而,使用rbcL、trnH-psbA和ITS2序列綜合分析,本實驗中涉及到的OTUs代表序列均能與參考數(shù)據(jù)庫中的開花植物物種序列相對應(yīng),物種劃分準確率為100%,結(jié)果見表 2。

表2 OTUs代表序列與參考數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果

rbcL：編碼核酮糖- 1,5-二磷酸羧化/加氧酶的大亞基Ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenas；psbA-trnH：psbA基因和trnH基因的間隔區(qū)序列Intergenic spacer region oftrnHandpsbAgene；ITS2：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Internal transcribed spacer

2.3 粉源植物種類及豐度分析

基于OTUs的分類結(jié)果,對白斑切葉蜂蜂糧樣本中粉源植物種類和相對豐度進行了統(tǒng)計分析(表1)。在科級分類階元上,共注釋到了菊科(Compositae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、藤黃科(Guttiferae)、豆科(Leguminosae)、唇形科(Labiatae)、馬錢科(Loganiaceae)、錦葵科(Malvaceae)、茜草科(Rubiaceae)和馬鞭草科(Verbenaceae)共9個科,其中以馬鞭草科植物為優(yōu)勢類群。在屬級分類階元上,共注釋到了金合歡屬(Acacia)、藿香薊屬(Ageratum)、鬼針草屬(Bidens)、醉魚草屬(Buddleja)、耳草屬(Hedyotis)、金絲桃屬(Hypericum)、忍冬屬(Lonicera)、鼠尾草屬(Salvia)、黃花稔屬(Sida)和黃荊屬(Vitex)共10個屬,其中以黃荊屬植物為優(yōu)勢類群。在種級分類階元上,共注釋到了兒茶(Acaciacatechu)、金合歡(Acaciafarnesiana)、藤金合歡(Acaciasinuata)、藿香薊(Ageratumconyzoides)、白花鬼針草(Bidensalbavar.radiata)、醉魚草(Buddlejalindleyana)、清遠耳草(Hedyotisassimilis)、金毛耳草(H.chrysotricha)、地耳草(Hypericumjaponicum)、忍冬(Lonicerajaponica)、藍花鼠尾草(Salviafarinacea)、佛光草(Salviasubstolonifera)、黃花稔(Sidaacuta)、黃荊(Vitexnegundo)和山牡荊(Vitexquinata)共15個種。其中以黃荊和山牡荊為優(yōu)勢種,相對豐度分別為49.08%和30%。4個樣地粉源植物種類之間有所不同,XYSB和JAGP均注釋到5種植物,優(yōu)勢種均為黃荊(分別為69.8%和74%)；GZSD注釋到9種植物,優(yōu)勢種為山牡荊(54.3%)；GZQYS注釋到12種植物,優(yōu)勢種為山牡荊(45.8%)和黃荊(26.6%)。4個樣地的共有優(yōu)勢種為黃荊(圖2)。

圖2 不同樣地白斑切葉蜂粉源植物組成及相對豐度Fig.2 Composition and relative abundance of pollen plants of Megachile strupigera from different sample plots

2.4 粉源植物多樣性分析

本研究選擇Chaol、Shannon-wiener和Simpson指數(shù)對單個樣本內(nèi)植物種類的豐富度和多樣性進行分析。Chaol指數(shù)反映樣本中群落的豐富度,Shannon-wiener指數(shù)反映樣本中群落的多樣性,Simpson指數(shù)反映樣本中優(yōu)勢種的集中程度。由表3可見,在七月上旬,GZSD和GZQYS的Chao1指數(shù)(分別為9.67±1.15和10.22±0.19)均顯著高于XYSB和JAGP的Chao1指數(shù)(均為5±0.00)；八月中旬,JAGP的Chao1指數(shù)最低(為2±0.00),XYSB和GZSD的Chao1指數(shù)相同(為3±0.00),GZQYS最高(為4±0.00),表明GZQYS具有最高的物種豐富度。GZSD和GZQYS在七月上旬的Shannon-wiener指數(shù)(分別為2.14±0.17和2.41±0.18)均顯著高于XYSB和JAGP的Shannon-wiener指數(shù)(分別為1.55±0.02和1.53±0.06)；八月中旬,GZQYS的Shannon-wiener指數(shù)(1.66±0.05)顯著高于XYSB、JAGP和GZSD(分別為0.91±0.15、0.62±0.25和0.95±0.25),表明GZQYS的物種多樣性最高。Simpson指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果與Shannon-wiener指數(shù)統(tǒng)計的總體趨勢成反比,表明GZQYS優(yōu)勢種的集中程度要高于XYSB、JAGP和GZSD。Choal指數(shù)和Shannon-wiener指數(shù)越大,Simpson指數(shù)越小,說明樣本中的物種豐富度和多樣性越高。因此,GZQYS粉源植物的豐富度和多樣性最高,其次是GZSD,較低為XYSB,最低的是JAGP。并且,4個樣地七月上旬的物種豐富度均明顯要高于八月中旬。

表3 白斑切葉蜂粉源植物的多樣性指數(shù)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；同列數(shù)據(jù)后相同的小寫字母表示樣本間差異不顯著(P> 0.05)

3 討論

DNA條形碼能更精確更迅速的鑒定出蜂糧中的物種組成,且不需要深厚的分類學研究基礎(chǔ)[17,20]。本研究運用該方法能有效鑒定出白斑切葉蜂蜂糧的植物群落組成。然而,不同基因序列的物種鑒定準確性差異較大。Bruni等[14]認為rbcL序列在蜂糧物種鑒定中的能力有限,而trnH-psbA是鑒定準確性相對較高的序列。Richardson等[26]認為ITS2序列在種內(nèi)和種間變異大,物種正確鑒定率高,具有較高的通用性。本研究,rbcL、trnH-psbA和ITS2在單獨進行物種鑒定時,部分物種不能準確鑒定到種。而采用rbcL+trnH-psbA+ITS2組合作為蜜蜂蜂糧的標準DNA條形碼,能準確的鑒定蜜蜂蜂糧中植物物種的組成。

本研究使用了克隆測序的方法來獲取樣本序列,共注釋到粉源植物15種,隸屬于9科,10屬。然而,白斑切葉蜂不同樣地之間的粉源植物豐富度具有一定的差異,尤其是七月上旬GZSD和GZQYS兩個樣地具有顯著高的物種豐富度。從Chao1指數(shù)分析中可以看出,GZSD和GZQYS樣地中估算的物種數(shù)分別為9.67±1.15和10.22±0.19,而本研究實際觀察到的物種數(shù)分別只有8和10種。4個樣地不同時期的物種豐富度表明,物種注釋數(shù)量的準確性隨著物種豐富度的增加而降低,一些樣本的實際物種數(shù)可能會被低估。另外,本研究并沒有鑒定到何波等[22]之前在野外觀察到的該蜂其他兩種訪花植物(紅根草Lysimachiafortunei和二歧蓼Polygonumdichotomum)。因此,我們認為挑取100個單克隆還不足以完全反應(yīng)出樣本的實際物種數(shù)量,但這對其主要OTUs的豐富度和多樣性影響不大。而高通量測序技術(shù)作為一種主流的研究方法,可更全面提高白斑切葉蜂粉源植物相對豐度的鑒定準確率。

傳粉服務(wù)功能對生態(tài)系統(tǒng)的維持和穩(wěn)定至關(guān)重要,而土地利用方式改變所引起的植物多樣性喪失已成為傳粉者多樣性喪失的主要驅(qū)動力之一[27- 28]。蜜蜂作為傳粉昆蟲的重要組成部分,與植物多樣性之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系[29- 32]。本研究發(fā)現(xiàn)不同林地利用方式對白斑切葉蜂粉源植物多樣性的影響非常明顯。XYSB和JAGP由于人為集約管理程度較高,人為干擾嚴重,導致粉源植物豐富度和多樣性較低；GZSD由于林區(qū)無人管理,林內(nèi)雜灌木較多,使粉源植物的豐富度和多樣性較高；而GZQYS地處保護區(qū)內(nèi),人為干擾程度最低,粉源植物組成最為豐富。由此表明,土地利用方式是影響白斑切葉蜂粉源植物多樣性的主要因素,這可能與人為干擾程度有關(guān)。

Requier等[33]研究發(fā)現(xiàn)：受當?shù)刂参锷锒鄻有院图竟?jié)性花期變化的影響,蜜蜂在不同時期或不同世代訪花差異性顯著。本研究通過對四種不同類型生境下白斑切葉蜂粉源植物組成進行分析,均顯示2種黃荊屬植物在該蜂蜂糧中的植物組成中占主導地位,其他植物數(shù)量較少。隨著花期的變化和世代的交替,該蜂訪花植物的種類呈降低的趨勢。但是,四個樣地不同時期的訪花植物種類又存在一定的交叉,且其主要訪花植物都為黃荊屬植物,即該蜂主要粉源植物種類沒有受到花期變化的影響。因此,我們認為黃荊和山牡荊是白斑切葉蜂主要的粉源植物,對維持白斑切葉蜂種群的穩(wěn)定具有重要作用。