基于卵母細(xì)胞線粒體探討早發(fā)性卵巢功能不全發(fā)生機(jī)制

朱軼軒，董曉英

(首都醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

卵巢功能減退是導(dǎo)致女性生活質(zhì)量下降的重要因素之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且缺乏有效臨床治療手段，是醫(yī)學(xué)界持續(xù)探索的重點(diǎn)領(lǐng)域之一。近年來(lái)，隨著有關(guān)領(lǐng)域研究的開(kāi)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)卵巢功能減退有了更加全面、客觀的認(rèn)識(shí)。早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的卵巢功能減退的重要階段之一，2016年才被正式提出，并在不久之后取代了“原發(fā)性卵巢功能不全”，逐漸被接受應(yīng)用。

根據(jù)《早發(fā)性卵巢功能不全臨床診療中國(guó)專家共識(shí)》，早發(fā)性卵巢功能不全是指女性在40歲之前由于卵巢生理功能喪失引發(fā)的一系列異常表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。其通常特征為低雌激素狀態(tài)導(dǎo)致的月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)、潮熱、盜汗、陰道干燥、性交痛、關(guān)節(jié)痛、泌尿系感染、焦慮、不孕癥、認(rèn)知功能異常等[2]，并伴有高水平FSH、LH和低水平E2[3]。POI的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色體正常，以往有過(guò)正常月經(jīng)；(2)小于40歲；(3)月經(jīng)稀發(fā)或停經(jīng)至少4個(gè)月以上；(4)4～6周內(nèi)，至少2次血清基礎(chǔ)FSH>25 U/L[4]。約1%的40歲以下女性患有POI，對(duì)于POI患者來(lái)說(shuō)，生育率下降是最嚴(yán)重的問(wèn)題之一，患者自然妊娠的幾率非常小，通常在4%～5%之間，對(duì)于當(dāng)代醫(yī)學(xué)來(lái)說(shuō)，POI的治療是一個(gè)重大挑戰(zhàn)[5]。

卵母細(xì)胞發(fā)育異常是POI的重要發(fā)病原因之一，其發(fā)育過(guò)程與卵母細(xì)胞線粒體有著密切聯(lián)系。本文旨在通過(guò)探討卵母細(xì)胞線粒體與POI的聯(lián)系，為POI的治療提供新思路。

一、卵母細(xì)胞線粒體功能及損傷機(jī)制概述

1.卵母細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能：線粒體是生物細(xì)胞內(nèi)一短棒狀細(xì)胞器，由外向內(nèi)依次有線粒體外膜、線粒體外室、線粒體內(nèi)膜、線粒體內(nèi)室等結(jié)構(gòu)。線粒體內(nèi)室中一般含有基質(zhì)顆粒、線粒體脫氧核糖核酸(Mitochondrial Deoxyribonucleic Acid，mtDNA)、線粒體核糖核酸(Mitochondrial Ribonucleic Acid，mtRNA)和其他參與呼吸鏈的各元件。卵母細(xì)胞線粒體是卵母細(xì)胞進(jìn)行氧化代謝的場(chǎng)所，負(fù)責(zé)卵母細(xì)胞有氧呼吸，產(chǎn)生ATP，為卵母細(xì)胞的成熟和受精提供能量，對(duì)卵母細(xì)胞的正常發(fā)育增殖具有重要意義，同時(shí)，卵母細(xì)胞線粒體DNA與呼吸鏈存在一定聯(lián)系，其突變可能會(huì)使卵母細(xì)胞代謝功能受損而死亡。因此，卵母細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常可能是許多卵巢相關(guān)疾病的重要發(fā)病原因(圖1)。

圖1 線粒體的生理特征示意圖

2.卵母細(xì)胞線粒體損傷的原因：機(jī)體的新陳代謝通常會(huì)產(chǎn)生具有高度活性的氧自由基，正常情況下，氧自由基的產(chǎn)生和清除會(huì)在機(jī)體的調(diào)控下維持平衡以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定，而在病理情況下，機(jī)體生成過(guò)量的氧自由基使得抗氧化防御系統(tǒng)受損，氧自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，機(jī)體就會(huì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[6]。由于線粒體中，電子傳遞鏈將電子從代謝物轉(zhuǎn)移到氧氣中，并將提取的能量作為膜電位儲(chǔ)存起來(lái)，作為生成ATP或熱量所需的膜電位。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，生物膜易被氧自由基破壞從而改變膜的結(jié)構(gòu)和活性，引起線粒體膜滲漏和通透性增加[7]。這些變化帶來(lái)的膜電位下降會(huì)使線粒體腫脹、線粒體嵴破壞或消失、基質(zhì)不可見(jiàn)[8]。同時(shí)，氧自由基還能直接攻擊DNA等生物大分子，作用于DNA時(shí)，會(huì)導(dǎo)致DNA鏈斷裂，增加DNA的基因組不穩(wěn)定性，改變細(xì)胞的基因表達(dá)[9]。卵母細(xì)胞mtDNA是典型的易受攻擊生物大分子，它缺少保護(hù)機(jī)制且修復(fù)系統(tǒng)受限，其中的嘌呤和嘧啶對(duì)氧自由基非常敏感，極易受到氧自由基侵襲而使DNA鏈斷裂，引起相關(guān)卵母細(xì)胞mtDNA基因控制的功能異?；蛉笔10]。

二、卵母細(xì)胞線粒體與POI

1.線粒體異常通過(guò)影響顆粒細(xì)胞正常功能導(dǎo)致的POI：卵母細(xì)胞線粒體通過(guò)代謝為顆粒細(xì)胞提供能量，以維持其正常功能。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間存在著大量縫隙連接，并通過(guò)縫隙連接輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)分子進(jìn)入卵母細(xì)胞，如氨基酸、核苷酸等，以促進(jìn)卵母細(xì)胞胞核與胞質(zhì)成熟。因此，卵母細(xì)胞線粒體可以通過(guò)顆粒細(xì)胞調(diào)控相應(yīng)的卵母細(xì)胞生理功能。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，線粒體膜通透性增加，過(guò)多Ca2+流入線粒體內(nèi)降低跨膜電位，同時(shí)活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)激增，二者共同作用誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡[11]。隨著女性年齡增長(zhǎng)，線粒體的老化會(huì)也會(huì)使線粒體自身的數(shù)量和內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生不利改變，活性和功能降低，對(duì)顆粒細(xì)胞的供能減少[12]，還會(huì)導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生的抗氧化酶或非酶性抗氧化物，如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶等減少，過(guò)剩氧自由基不能得到及時(shí)清除，機(jī)體的氧化系統(tǒng)處于優(yōu)勢(shì)地位，顆粒細(xì)胞更容易受到ROS攻擊[13-14]。顆粒細(xì)胞中的細(xì)胞死亡配體和細(xì)胞死亡受體系統(tǒng)是卵泡顆粒細(xì)胞的關(guān)鍵存活因子或凋亡因子，充當(dāng)著卵泡發(fā)育或閉鎖的誘導(dǎo)物[15]。當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡時(shí)，卵母細(xì)胞會(huì)失去進(jìn)行生理活動(dòng)所需的信號(hào)和能量而停止發(fā)育，發(fā)生閉鎖，引起卵巢儲(chǔ)備功能下降(decreased ovarian reserve，DOR)。臨床資料表明，部分卵巢儲(chǔ)備功能問(wèn)題的積累會(huì)進(jìn)一步損傷卵巢的其他功能，引起POI[16]。

2.mtDNA異常引起的 POI：mtDNA是位于線粒體基質(zhì)的雙鏈環(huán)狀DNA，其所有基因都位于該單一環(huán)狀DNA分子上。人體的mtDNA在ATP合成過(guò)程中不受組蛋白的保護(hù)幾乎裸露于線粒體基質(zhì)中[17]，這使得它成為容易發(fā)生基因重組突變的部位。對(duì)于真核生物而言，線粒體基因組不同于核基因組，因?yàn)橛H代精子的mtDNA在受精的過(guò)程中不可以進(jìn)入卵母細(xì)胞，子代mtDNA 全部來(lái)自于母系，不發(fā)生再結(jié)合，所以mtDNA的遺傳過(guò)程屬于母系遺傳[18]，因此，人體只能通過(guò)卵母細(xì)胞傳遞mtDNA攜帶的遺傳信息。卵母細(xì)胞mtDNA的拷貝數(shù)決定了細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量[19]，同時(shí)mtDNA又控制著呼吸鏈和氧化磷酸化體系[20]，可以說(shuō)是卵母細(xì)胞線粒體的“中樞”。

實(shí)驗(yàn)證明，隨著女性年齡的增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞內(nèi)的mtDNA拷貝數(shù)會(huì)明顯減少，引起線粒體數(shù)量的下降、卵母細(xì)胞凋亡以及胚胎發(fā)育阻滯[21]。由于卵母細(xì)胞mtDNA呈低氧化磷酸化代謝狀態(tài)且缺少組蛋白的保護(hù)，相較于其他細(xì)胞的mtDNA更容易受到ROS攻擊[22-23]，尤其是在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，mtDNA發(fā)生缺失或突變的概率會(huì)大大增加[24]。mtDNA具有很多突變形式，最常見(jiàn)的是ΔmtDNA4977片段缺失，該片段控制著ATPase6、ATPase8、NADH脫氫酶亞基3(NADH dehydrogenase subunit 3，ND3)、ND4L、ND4、ND5等線粒體基因核苷酸，一經(jīng)突變，通常會(huì)損傷mtDNA編碼的氧化磷酸化相關(guān)蛋白的合成[25-26]。

卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)減少將引起線粒體數(shù)量下降甚至卵母細(xì)胞凋亡，這都會(huì)使線粒體功能減退進(jìn)而導(dǎo)致卵母細(xì)胞因供能不足，無(wú)法正常完成生理活動(dòng)[21]。mtDNA的重組突變可能會(huì)降低線粒體蛋白質(zhì)的翻譯水平，使呼吸鏈產(chǎn)生一定的缺陷，阻礙線粒體發(fā)揮其正常功能[27]，同樣會(huì)影響卵母細(xì)胞的正常發(fā)育。若mtDNA的不利改變超出機(jī)體調(diào)節(jié)范圍，會(huì)加速卵母細(xì)胞衰老，降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，為POI埋下隱患(圖2)。

圖2 ROS攻擊mtDNA對(duì)細(xì)胞功能影響的示意圖

3.線粒體分裂和融合功能異常引發(fā)的POI：線粒體是一種高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，它的正常工作需要分裂和融合來(lái)調(diào)節(jié)自身動(dòng)態(tài)以完成線粒體內(nèi)物質(zhì)的交換，當(dāng)線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，引發(fā)線粒體功能缺陷時(shí)，受損線粒體可與正常線粒體通過(guò)融合分裂作用互換內(nèi)容，從而改善線粒體結(jié)構(gòu)缺陷并恢復(fù)其正常功能[28]。因此，線粒體的分裂和融合功能是“重塑”線粒體的重要手段。

線粒體融合基因2(Mitofusin，Mfn2)是分布于線粒體外膜的融合蛋白之一，具有高度保守的線粒體跨膜GTP酶(guanosine triphosphate ase，GTPase)功能[29]。該基因控制著線粒體的融合功能。同時(shí)，細(xì)胞中還存在一種dynamin樣的GTPase分子(Dynamin 1 like，DNM1L)，該分子介導(dǎo)著線粒體的分裂[30]。這兩者對(duì)線粒體維持分裂和融合動(dòng)態(tài)平衡有著重要意義。在卵母細(xì)胞中，正常水平的Mfn2表達(dá)能通過(guò)融合作用使卵母細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能維持正常，而DNM1L則能夠防止線粒體驟增聚團(tuán)，二者共同作用保證了卵母細(xì)胞能夠順利進(jìn)行代謝，防止卵巢功能受損[23]。

有研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2蛋白和DNM1L表達(dá)量異常的小鼠，其卵巢組織內(nèi)的ATP含量較低，而卵巢組織內(nèi)ATP含量的降低通常伴隨著線粒體結(jié)構(gòu)功能的變化[29]。實(shí)驗(yàn)證明，Mfn2蛋白和DNM1L表達(dá)量異常的小鼠會(huì)因?yàn)槁涯讣?xì)胞線粒體融合與分裂失衡而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，線粒體膜電勢(shì)下降，ATP合成減少，卵母細(xì)胞紡錘體的組裝和極體排放受阻，卵母細(xì)胞出現(xiàn)異常染色體排列和非整倍體，從而引發(fā)卵巢功能下降[24]。這種卵母細(xì)胞線粒體融合與分裂失衡容易在女性身上積累對(duì)卵母細(xì)胞的不利影響，引發(fā)POI。

三、基于改善卵母細(xì)胞線粒體的POI治療方法

卵母細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變導(dǎo)致的卵母細(xì)胞代謝受損是引起POI的重要原因之一，因此，改善卵母細(xì)胞線粒體質(zhì)量也是治療POI的有效手段之一。目前臨床上基于卵母細(xì)胞線粒體可用的POI治療方法包括胞漿移植、異體體細(xì)胞線粒體移植以及自體體細(xì)胞線粒體移植等[31]。

1.胞漿移植：是指將受精卵的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到另一女性的健康去核卵母細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞重組的一種治療方法，卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)是臨床上一種治療不孕的胞漿移植相關(guān)方法[2]。但是胞漿移植缺乏動(dòng)物模型的驗(yàn)證，移植成分復(fù)雜，不確定性較大，有關(guān)影響胞漿移植的因素如子線粒體功能、凋亡機(jī)制、遺傳、母體轉(zhuǎn)錄物的存活、蛋白質(zhì)和離子等方面的研究報(bào)道較少[32]，難以付諸臨床應(yīng)用。

2.異體體細(xì)胞線粒體移植：是指將不孕女性的線粒體更換為其他健康女性的線粒體的一種治療方法[33]，Cohen等[34]用顯微注射的方法將年輕婦女卵子5%～10%的細(xì)胞質(zhì)注入體外受精反復(fù)失敗患者和生育年齡較大患者的卵子內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎質(zhì)量明顯改善，并有健康的胎兒出生。但是，因?yàn)檫@種治療方法的倫理爭(zhēng)議較大，實(shí)驗(yàn)基數(shù)小，其安全性和可行性仍有待確定。

3.自體體細(xì)胞線粒體移植：是用自身其他組織內(nèi)健康細(xì)胞線粒體更換卵母細(xì)胞線粒體的一種治療方案[35-37]。目前臨床上已證實(shí)自體卵丘顆粒細(xì)胞線粒體移植技術(shù)能顯著改善卵母細(xì)胞質(zhì)量[38]。最近，梁曉燕教授團(tuán)隊(duì)也在世界上首次利用“卵母細(xì)胞內(nèi)注射自體骨髓細(xì)胞線粒體”技術(shù)為一患者改善了胚胎質(zhì)量[39]，為自體體細(xì)胞線粒體移植治療方法提供了新思路。此外，還有培養(yǎng)卵原干細(xì)胞以獲得線粒體來(lái)源等新興技術(shù)[40]。

四、展望

線粒體是人體最重要的細(xì)胞器之一，越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)線粒體與許多難以治療的疾病有著密切聯(lián)系。在卵巢內(nèi)，卵母細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能的變化可以通過(guò)供能、氧化應(yīng)激和凋亡等途徑影響卵巢功能引發(fā)POI。迄今為止，基于卵母細(xì)胞線粒體探討POI發(fā)病機(jī)制的研究尚處于起步階段，相關(guān)實(shí)驗(yàn)無(wú)論是種類、規(guī)模還是精確性都還不足以完全支撐已有的POI發(fā)病機(jī)制理論，且臨床上的相關(guān)治療方案還沒(méi)有成熟。在未來(lái)的研究中，除了完善已有實(shí)驗(yàn)，提高已有實(shí)驗(yàn)的可信度和說(shuō)服力外，還可以試著從卵母細(xì)胞線粒體區(qū)別于其他細(xì)胞線粒體的獨(dú)特性入手，通過(guò)更多方面的實(shí)驗(yàn)探索針對(duì)線粒體異常引發(fā)的卵巢相關(guān)疾病的個(gè)性治療方案?；蛘呖梢匝芯繉?duì)卵母細(xì)胞線粒體更精準(zhǔn)的物理操作方案，填補(bǔ)POI治療領(lǐng)域的相關(guān)空白。