蒙藥給旺-9味對D-氨基半乳糖誘導急性肝衰竭模型大鼠免疫功能的影響＊

鬧 敏，王月洪，烏日嘎，贊 根，蘇麗婭

（內蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥學院 呼和浩特 010110）

ALF 是一種起病急、進展迅速、預后兇險的疾病和綜合征[1]。其發(fā)病機制復雜且尚不完全明確，有學者[2]提出肝衰竭發(fā)生發(fā)展過程中，除了大量肝細胞死亡還存在2種典型重要改變：炎癥細胞浸潤與微循環(huán)障礙；分別反映肝衰竭時出現(xiàn)的免疫損傷與缺血缺氧及再灌注損傷，肝組織依次經受這三重致死性打擊是ALF 走向不可逆轉結局的主要推動機制。面對ALF治療陷入瓶頸期的情況[3-5]，阻斷疾病發(fā)展的主要推動機制，掃除有效防治策略建立上的障礙迫在眉睫。蒙藥給旺-9味為蒙醫(yī)治療肝損傷的經典方，廣泛用于肝熱、肝血熾盛熱、肝硬化、脂肪肝、急性肝損傷、病毒性肝炎、酒精性肝損傷等疾病療效顯著[6]。有研究表明給旺-9 具有保肝作用以及調節(jié)脂質代謝和抗脂質過氧化的作用[7-11]。另外本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蒙藥給旺-9可明顯減輕D-GalN 誘導ALF 模型大鼠的血清轉氨酶水平，明顯減輕肝細胞壞死程度，減輕炎性細胞浸潤等?；诮o旺-9 味在治療肝膽疾病方面具有優(yōu)勢和前景且在阻斷ALF 發(fā)展的主要推動機制中有一定的作用，本研究通過觀察給旺-9對ALF 模型大鼠肝臟細胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等指標的影響以及對形態(tài)學的影響從免疫調控作用角度探討蒙藥給旺-9 保肝作用，為該藥防治ALF 提供實驗依據(jù)，并為其后續(xù)保肝作用機制研究提供實驗基礎，同時為揭示肝衰竭的發(fā)病機制提供新的思維方式并使其更好地應用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

清潔級成年雄性SD 大鼠（北京市斯貝福生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002）；大鼠被飼養(yǎng)于內蒙古醫(yī)科大學動物實驗室，大鼠詞料由該實驗中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：清潔級動物詞養(yǎng)室，室溫15-20℃，濕度（60-80）%，定時通風換氣，自然明暗周期。

1.2 藥品

D-GalN（美國sigma 公司，準字號：G500）；給旺-9味（庫倫制藥廠，國家準字號：Z15020878）；復方甘草酸苷，商品名：美能（中國材藥業(yè)有限公司準字號：17259）；伊紅染液（成都成科匯博科技有限公司，批號：G1040）；蘇木素染液（成都成科匯博科技有限公司，G1140）；中性樹膠（北京索萊寶有限公司，G8590）；Leica石蠟（德國Leica公司，批號39601006）。

1.3 主要試劑

氫氧化鈉（天津永晟精細化工有限公司，準字號：0140101）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（國藥集團化學試劑有限公司，準字號：F20100407）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，準字號：20171211）；AST、ALT 試劑盒、IL-2，6 試劑盒、TNF-α試劑盒、IFN-γ試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，準字號：201907）。

1.4 主要儀器

TOSHIBA 全自動生化分析儀，型號：Accute TBA-40FR；酶標儀：北京普朗新技術有限公司，型號：DNM-960；離心機：微量高速離心機（國產）型號：TG16W；LeicaRM2235 輪轉式切片機；LeicaHI1210 攤片機；LeicaHI220 烘片機；LeicaDFC450 顯微鏡；YD-12G 生物組織脫水機。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥

將72 只清潔級雄性SD 大鼠隨機分為六組：空白組、模型組、陽性組、蒙藥給旺-9 味低中高劑量三組，各12 只，給予普通飲食適應性喂養(yǎng)7 天，次日開始給藥，所有藥物均以0.5% CMC-Na 為溶媒，換算等效臨床劑量后，陽性藥美能組0.45 g·kg-1·天-1，蒙藥給旺-9味低、中、高劑量組分別（0.4 g、0.8 g、1.6 g）·kg-1·天-1劑量灌胃，空白組與模型組給予等容量0.5%CMC-Na 以作對照。灌胃體積20 mL·kg-1，每日一次，連續(xù)10天。

2.2 動物模型的建立

末次給藥后禁食12 h，除空白組外，其余各組大鼠單次腹腔注射600 mg·kg-1D-GalN（D-GalN 溶于無菌生理鹽水中，用1 mmol·L-1的NaOH 將pH 調至7.0，配置成濃度為10% 的溶液，根據(jù)預實驗結果選定600 mg·kg-1為最佳造模）進行造模。造模2 h 后立即給予相應藥物灌胃，間隔12 h 后再灌胃1 次，方法同上。

2.3 標本釆集與處理

動物處死前24 h，禁食不禁水。D-GalN 造模后48 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，促凝管接血，3000 rpm 速度離心15 min，取上清液，存放于-20℃冰箱待檢。處死動物分離出肝組織，裝于DEPC水處理過的EP 管中，放置液氮中快速冷凍，然后轉移至-80℃超低溫冰箱保存待測。取肝右葉固定部位染色、顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學變化。

2.4 觀察指標

大鼠血清肝功能指標檢測：采用全自動生化分析儀嚴格按照試劑說明測定血清ALT、AST；肝組織免疫指標檢測：肝勻漿取上清液采用Ellisa 法檢測IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ；組織病理形態(tài)學學觀察。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析，計量資料±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 各組大鼠血清中的AST、ALT水平

與空白組比較，模型組大鼠血清AST、ALT水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（#P＜0.05），模型成立；與模型組比較，陽性組、蒙藥低、中劑量組均顯著降低ALT水平，差異有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05）（表1）。

4.2 各組大鼠肝臟中的IL-2、IL-6、TNF-a、IFN-γ 水平（表2）

4.2.1 IL-2

與空白組比較模型組IL-2水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）、蒙藥低、中劑量組IL-2水平差異均有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低IL-2 水平，差異均有統(tǒng)計學意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組IL-2水平差異有統(tǒng)計學意義（+P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中的AST、ALT（±s，n = 12）

表1 各組大鼠血清中的AST、ALT（±s，n = 12）

注：#P ＜0.05 vs blank group；*P ＜0.05 vs model group

組別空白組模型組陽性組低劑量組中劑量組高劑量組AST/（pg·mL-1）119.73±13.111145.20±630.16#109.46±513.82#4358.32±3947.695442.888±3211.8#5527.03±3506.12 ALT/（pg·mL-1）31.64±3.841091.81±209.15#631.91±293.79#*500.96±305.28#*208.31±160.78*644.225±389.69#

4.2.2 IL-6

與空白組比較模型組IL-6水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）、蒙藥低、中劑量組IL-6水平差異均有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低IL-6 水平，差異均有統(tǒng)計學意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組IL-6水平差異有統(tǒng)計學意義（+P＜0.01）。

4.2.3 TNF-α

與空白組比較模型組TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）、蒙藥低、中劑量組TNF-a水平差異均有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低TNF-a 水平，差異均有統(tǒng)計學意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組TNF-a水平差異均有統(tǒng)計學意義（+P＜0.01）。

4.2.4 IFN-γ

與空白組比較模型組IFN-γ水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）、陽性組、蒙藥組IFN-γ水平差異均有統(tǒng)計學意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低IFN-γ水平，差異均有統(tǒng)計學意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組IFN-γ水平差異均有統(tǒng)計學意義（+P＜0.01）。

4.3 肝臟病理形態(tài)學結果

鏡下模型組肝組織結構紊亂、肝索形態(tài)不清晰、肝細胞腫脹變形，大部分彌漫性中度至重度氣球樣水腫、偶可見肝細胞輕度脂肪變性，匯管區(qū)可見不同程度的細胞浸潤，竇內皮輕到中度增生以及不同程度的膽管增生，鏡下視野可見彌漫性大片狀及橋接樣壞死為主，可見多處核固縮，溶解，碎裂。給旺-9味組肝組織鏡下：肝板排列，肝索形態(tài)未見明顯好轉、低劑量水腫程度無明顯改善，中劑量和高劑量組肝細胞水腫較其它組減輕多數(shù)以輕度水腫為主，高、中劑量組脂肪變性較模型組減輕，匯管區(qū)周圍炎細胞浸潤減輕，偶見竇內皮增生，高中低劑量組膽管增生均明顯改善，低劑量組肝細胞壞死仍有橋接壞死及碎片狀壞死，中、高劑量組壞死區(qū)域明顯改善以點狀壞死和碎片狀壞死為主，高劑量組鏡下視野多見彌漫性出血，中劑量組偶見。總結：蒙藥組可明顯減輕肝組織細胞水腫，炎癥變性，壞死表現(xiàn)，蒙藥高劑量組肝細胞壞死程度最輕。

5 討論

表2 各組大鼠肝臟中的IL-2、IL-6、TNF-a、IF-γ（±s，n= 12）

表2 各組大鼠肝臟中的IL-2、IL-6、TNF-a、IF-γ（±s，n= 12）

注：#P ＜0.01vs blank group；*P ＜0.01，*P ＜0.05 vs model group；+P ＜0.01 vs control group

組別空白組模型組陽性組低劑量組中劑量組高劑量組IL-2/（pg·mL-1）114.351±5.112226.457±55.458#121.084±15.712*186.806±13.689#*+153.142±19.253#*+123.965±28.046*IL-6/（pg·mL-1）96.226±2.906141.856±8.201#99.849±6.377*134.2±12.813#*+127.30±8.996#a+100.679±10.421*TNF-a/（pg·mL-1）172.020±34.984582.471±86.011#202.329±28.998*466.28±57.097#*+262.72±37.774#*+198.139±3.922*IFN-γ（pg·mL-1）97.084±14.000243.822±8.594#116.629±14.944#*196.928±7.275#*+152.888±3.750#*+123.948±8.122#*

ALF 的病理損傷涉及過度免疫，炎癥性細胞因子網絡的激活，肝細胞的凋亡和壞死，脂質過氧化反映等在內的多種機制。本研究中采用的D-GlaN 誘導急性肝臟衰竭模型通過能量耗竭、鈣離子內流、破壞肝細胞膜的完整性而引起肝臟原發(fā)性損傷,還可以促進內毒素的產生，激活肝臟的Kupffer 細胞，導致一系列炎癥因子的釋放，炎癥因子的過度表達引起肝臟二次打擊[12]可以促進活性氧的產生，引起肝臟的過氧化增強、代謝紊亂[13-16]加重肝臟損害，最后導致肝細胞大量死亡，炎性細胞浸潤，微循環(huán)障礙等肝臟的三重打擊，符合急性肝功能衰竭的臨床表現(xiàn)、病理變化、生化、凝血功能等[17]。肝功能檢查血清轉氨酶的變化是反映肝細胞損害的敏感指標，其中普遍以ALT、AST作為觀察指標，ALT在肝臟中的含量最豐富，AST屬細胞內功能酶，肝細胞受損或壞死后ALT、AST 釋放入血中[18]。血清中的ALT、AST 升高時，肝臟組織的ALT、AST 活力下降，進而肝細胞代謝發(fā)生一系列障礙，即大量的肝細胞壞死導致的免疫功能失調往往會對肝臟進行第二次打擊，進一步加重肝損傷。本研究肝功結果顯示：與空白對照組比較，模型組血清ALT、AST 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），組織形態(tài)學結果中模型組鏡下肝組織結構紊亂、肝索形態(tài)不清晰、肝細胞中度至重度水腫、細胞浸潤、膽管增生，彌漫性大片狀及橋接樣壞死為主，多處核固縮，溶解，碎裂等，以上提示造模成功。ALF 的發(fā)病機制是一個復雜的系統(tǒng)，被多數(shù)學者支持的“二次打擊學說”還是“三重打擊學說”都貫穿整個發(fā)病過程，免疫失衡是它們持續(xù)損傷肝組織的根本原因。IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ是肝衰竭發(fā)病機制信號通路較典型的免疫指標[19，20]。本研究免疫指標檢測結果顯示：與空白組比較，模型組肝組織細胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明顯升高，而與模型組比較，蒙藥給旺-9 低、中、高劑量組均能顯著降低肝組織細胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），與陽性組比較，蒙藥低、中劑量組IL-2、IL-6、TNF-α、IFNγ水平差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），蒙藥高劑量組降低肝組織IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平效果與美能片接近。提示蒙藥給旺-9可顯著降低D-GlaN 所誘導的ALF 模型大鼠肝組織細胞因子IL-2、IL-6、TNFα、IFN-γ。病理形態(tài)學結果顯示蒙藥組較模型組可明顯減輕肝組織細胞水腫，炎癥變性，壞死表現(xiàn)，且蒙藥高劑量組肝細胞壞死程度最輕。給旺-9味下調IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ表達水平，從源頭治療阻斷疾病發(fā)展的主要推動機制，能夠減輕肝細胞的損傷具有明顯保肝作用，具體作用機制與調節(jié)肝組織免疫平衡，減輕其炎性反應有關。

本研究中采用的蒙藥給旺-9 味是蒙醫(yī)治療肝熱性病經典方，方中以牛黃為主藥，清肝熱，解毒；輔以瞿麥清血熱、鎮(zhèn)刺痛、解毒；五靈脂清肝熱、止痛、調和體素；印度獐芽菜鎮(zhèn)希拉，清熱解毒；木香調和體素，止痛，共為佐藥。使以紅花清肝熱，鎖脈；關木通清肝熱，清腑熱。諸藥合奏清肝熱之效。給旺-9具有蒙藥方劑多成分、多靶點、多系統(tǒng)性的共性特點，本研究為其后續(xù)作用機制研究提供了一定實驗依據(jù)，同時為揭示肝衰竭的發(fā)病機制提供新的思維方式并使其更好地應用于臨床提供了理論依據(jù)。