四君子湯對(duì)脾氣虛證模型大鼠股四頭肌線粒體自噬和細(xì)胞凋亡水平的影響＊

段志園，許欣竹，謝 鑫，劉文俊，陳 靖，柴紀(jì)嚴(yán)，吳成舉，單德紅＊＊

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 沈陽(yáng) 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院 沈陽(yáng) 110847；3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 沈陽(yáng) 110847）

線粒體產(chǎn)能（三磷酸腺苷，ATP）為細(xì)胞執(zhí)行生物學(xué)功能提供動(dòng)力；骨骼肌富含線粒體，其收縮需消耗大量ATP，線粒體損傷則收縮力下降。線粒體不僅決定細(xì)胞生存，還決定細(xì)胞死亡，這是因?yàn)檠趸姿峄∣xidative phosphorylation，OXPHOS）過(guò)程中活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）異常積累可損害其功能。對(duì)此，宿主細(xì)胞可啟動(dòng)線粒體自噬機(jī)制清除損傷，如不能及時(shí)清除，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1，2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證大鼠肌力下降與骨骼肌OXPHOS 損傷和自噬紊亂有關(guān)，但其是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡尚不完全清楚[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾氣虛則四肢不用”，可治以四君子湯。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成，是健脾益氣的代表方劑。已有研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯可提高脾氣虛證大鼠骨骼肌線粒體生物合成進(jìn)而提高肌力[4，5]，但其對(duì)線粒體自噬的作用并不清楚，其是否影響細(xì)胞凋亡也未見報(bào)道。為此，本研究主要圍繞線粒體自噬和細(xì)胞凋亡機(jī)制，以脾氣虛證大鼠股四頭肌線粒體為對(duì)象，探討四君子湯治療“脾氣虛四肢不用”的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

50 只SPF級(jí)7 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200 ±10）g，購(gòu)于遼寧省本溪巿實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（遼）-2010-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（遼）-2013-000-9。室溫18-23℃，相對(duì)濕度45-55%，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 倫理審查

項(xiàng)目通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，批準(zhǔn)號(hào)：20151205。

1.3 儀器與試劑

BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)：K20316，TransGen 公司）、組織線粒體分離試劑盒（批號(hào)：C3606，Beyotime公司）、ATP 含量測(cè)定試劑盒（批號(hào)：201901，南京建成生物工程研究所）、過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0038，Beyotime 公司）、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C1071S，Beyotime 公 司）、LC3B 抗 體（批 號(hào)：3199111-5，Abcam 公司）、p62 抗體（批號(hào)：00052579，Proteintech 公 司）、Bcl-2 抗 體（批 號(hào)：00012789，Proteintech 公 司）、Bax 抗 體（批 號(hào)：00050599，Proteintech 公 司）、Cyt-c 抗 體（批 號(hào)：00010933，Proteintech 公司）、Caspase3 抗體（批號(hào)：00058210，Proteintech 公司）、PARP 抗體（批號(hào)：9532T-9，CST 公司）、GAPDH 抗體（批號(hào)：L10515，Proteintech 公司）、COX-4 抗體（批號(hào)：10001421，Proteintech 公司）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗（批號(hào)：7074P2，CST公司）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗鼠二抗（批號(hào)：20000002，Proteintech 公司）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)：M20926，TransGen 公司）。高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific）、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Tecan infinite 200Pro）、超聲破碎儀、電泳儀（Bio-Rad）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer System）、顯影儀（Tanon 5200）。

2 方法

2.1 動(dòng)物

大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和脾氣虛證模型組（n=40）。按文獻(xiàn)[3,6]方法復(fù)制和評(píng)價(jià)飲食失節(jié)＋勞倦型脾氣虛證模型。造模結(jié)束后，將脾氣虛證模型組大鼠分為四君子湯治療低、中、高劑量治療組和鹽水組，每組10 只，常規(guī)飼喂。人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房并煎煮，按成人劑量折算為大鼠灌胃中劑量（1.40 g·mL-1），× 2 為高劑量（2.80 g·mL-1），1/2 為低劑量（0.70 g·mL-1），鹽水組灌胃等體積生理鹽水，療程2周。

2.2 ATP、MMP和ROS水平

按文獻(xiàn)[3]方法裂解股四頭肌組織，分別測(cè)定ATP和H2O2含量（間接評(píng)價(jià)ROS 水平）[7]；提取線粒體，測(cè)定MMPs，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。去除線粒體的胞漿蛋白用于后續(xù)測(cè)定Cyt-c蛋白表達(dá)。

2.3 LC3B、p62、Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3和PARP蛋白表達(dá)

采用Western blot 法，其中LC3B、p62 蛋白表達(dá)使用上述線粒體提取物，Cyt-c 使用胞漿蛋白，Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3、PARP 使用總蛋白；總蛋白/線粒體裂解液裂解肌組織/線粒體沉淀；BCA 蛋白定量；以30 μg 蛋白計(jì)算加樣量，SDS-PAGE 凝膠電泳；PVDF 轉(zhuǎn)膜（0.25 μm）；5%BSA 封閉1 h；4℃搖床孵育16 h；TBST 洗膜；二抗孵育1 h；TBST 洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影。AlphaView SA 軟件灰度分析；目的蛋白/COX-4或GAPDH計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 抓力和體質(zhì)量

與對(duì)照組比較，鹽水組抓力和體質(zhì)量下降（P ＜0.05，P＜0.01）。與鹽水組比較，低劑量組二者未見差異（均P＞0.05）；中、高劑量組抓力升高（均P＜0.01）；體質(zhì)量未見差異（均P＞0.05）。與中劑量組比較，高劑量組二者未見差異（均P＞0.05）（表1）。

表1 5組大鼠抓力與體質(zhì)量水平（±s；n = 10）

表1 5組大鼠抓力與體質(zhì)量水平（±s；n = 10）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與鹽水組比較，##P ＜0.01

對(duì)照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組抓力/g 1835.2±195.151453.0±319.59**1507.6±198.501668.6±215.95##1731.6±263.74##體質(zhì)量/g 396.58±15.96310.36±18.59*299.89±12.51303.02±13.60300.74±12.55

3.2 ATP、MMP和H2O2水平

與對(duì)照組比較，鹽水組股四頭肌ATP、MMP 水平下降（均P＜0.001），H2O2水平升高（P＜0.05）。與鹽水組比較，低劑量組三者未見差異（均P＞0.05）；中、高劑量組ATP、MMP 水平升高（P＜0.01或P＜0.001），H2O2水平下降（P＜0.05，P＜0.01）。與中劑量組比較，高劑量組ATP、MMP 水平未見差異（均P＞0.05），H2O2水平下降（P＜0.05）（表2）。

表2 5組大鼠股四頭肌ATP、MMP和H2O2水平（±s；n = 6）

表2 5組大鼠股四頭肌ATP、MMP和H2O2水平（±s；n = 6）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001；與鹽水組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001；與中劑量組比較，△P ＜0.05

對(duì)照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組ATP（μM）11.20±0.664.12±0.15***4.54±0.299.36±1.01###9.47±1.04##MMP 4.838±0.4891.937±0.576***2.030±0.5003.670±0.178##3.800±0.561##H2O2（μM）1.134±0.1981.532±0.138*1.206±0.1841.030±0.149#0.809±0.127##△

3.3 LC3B、p62蛋白表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，鹽水組股四頭肌LC3B-II 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），p62 表達(dá)下降（P＜0.001）。與鹽水組比較，低劑量組二者表達(dá)未見差異（均P ＞0.05）；中、高劑量組LC3B-II 表達(dá)下降（均P＜0.05），p62 表達(dá)升高（均P＜0.05）。與中劑量組比較，高劑量組二者表達(dá)未見差異（均P ＞0.05）（圖1、表3）。

圖1 5組大鼠股四頭肌LC3B及p62蛋白印跡分析

表3 5組大鼠股四頭肌LC3B及p62蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s；n = 4）

表3 5組大鼠股四頭肌LC3B及p62蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s；n = 4）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001；與鹽水組比較，#P ＜0.05

對(duì)照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組LC3B 0.977±0.1121.174±0.118*1.211±0.1790.920±0.125#1.007±0.146#p620.470±0.0650.252±0.016***0.241±0.0340.412±0.034#0.497±0.017#

3.4 Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3、PARP 蛋白表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，鹽水組股四頭肌Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3 和PARP 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），Bcl-2表達(dá)下降（P＜0.001）。與鹽水組比較，低劑量組各蛋白表達(dá)未見差異（均P＞0.05）；中、高劑量組Bax、Cytc、cleaved-Caspase3 和PARP 表達(dá)下降（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），Bcl-2 表達(dá)升高（均P＜0.01）。與中劑量組比較，高劑量組Bax 表達(dá)下降（P＜0.01），其余表達(dá)未見差異（均P＞0.05）（圖2、表4）。

4 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證模型大鼠肌力下降，但四君子湯對(duì)其是否具有修復(fù)作用并不清楚[3]。為此，我們檢測(cè)了不同濃度四君子湯對(duì)脾氣虛證模型大鼠抓力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中、高劑量四君子湯能夠提高大鼠肌力。

線粒體產(chǎn)能是細(xì)胞執(zhí)行生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，也是“脾主肌肉”的重要環(huán)節(jié)，骨骼肌富含線粒體，其收縮需消耗大量ATP，線粒體損傷則收縮力下降。前期研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛證模型大鼠呼吸鏈代謝產(chǎn)物ATP、MMP 水平下降，H2O2水平升高，推測(cè)四君子湯可能通過(guò)影響呼吸鏈代謝提高肌力。為此我們進(jìn)一步檢測(cè)了不同濃度四君子湯治療脾氣虛證模型大鼠股四頭肌ATP、MMP 和H2O2水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中、高劑量四君子湯均能減少ROS 積累，恢復(fù)MMP 并提高線粒體產(chǎn)能，不僅如此，高劑量四君子湯對(duì)ROS 的清除作用更加顯著。

表4 5組大鼠股四頭肌Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3及PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s；n = 4）

表4 5組大鼠股四頭肌Bcl-2、Bax、Cyt-c、cleaved-Caspase3及PARP蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s；n = 4）

對(duì)照組鹽水組低劑量組中劑量組高劑量組Bcl-20.731±0.0670.452±0.048***0.529±0.1170.628±0.143##0.620±0.102##Bax 0.533±0.0811.018±0.166***0.992±0.1770.751±0.185##0.430±0.040###△△Cyt-c 0.879±0.1011.017±0.119*0.890±0.0780.812±0.114#0830±0.129#Caspase30.288±0.0320.433±0.081**0.430±0.0110.309±0.023#0.275±0.051#PARP 0.704±0.0961.002±0.177**1.025±0.1610.800±0.100#0.676±0.099##

MMP正常是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件，維持其穩(wěn)定有利于發(fā)揮細(xì)胞的正常生理功能；ROS 作為線粒體代謝副產(chǎn)物，其異常積累可組成攻膜復(fù)合體，損害MMP進(jìn)而影響產(chǎn)能，如持續(xù)積累，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)此，細(xì)胞可啟動(dòng)線粒體自噬機(jī)制清除損傷，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8，9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)脾氣虛證模型大鼠股四頭肌線粒體自噬紊亂，但細(xì)胞凋亡情況不明，四君子湯是否能夠影響自噬和凋亡機(jī)制也并不清楚。

線粒體自噬是細(xì)胞選擇性降解損傷線粒體的分解代謝過(guò)程。LC3B 是自噬過(guò)程中的特異性信號(hào)蛋白，其具備兩種空間構(gòu)象，在自噬發(fā)生時(shí)，LC3B-I 與PE 泛素樣結(jié)合并轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3B-II，LC3B-II 與下游自噬相關(guān)受體結(jié)合，啟動(dòng)自噬過(guò)程；而p62作為自噬的底物常與LC3B-II 共同作為衡量自噬流的標(biāo)準(zhǔn)[10-12]。適度水平自噬有利于維持能量供應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)線粒體損傷嚴(yán)重時(shí)，線粒體無(wú)法通過(guò)有效自噬清除損傷，自噬紊亂可導(dǎo)致凋亡因子如Cyt-c 等釋放入胞漿，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脾氣虛證模型大鼠股四頭肌線粒體自噬水平升高，經(jīng)中、高劑量四君子湯治療后線粒體自噬水平下降。該結(jié)果提示，脾氣虛狀態(tài)下股四頭肌線粒體自噬水平上調(diào)，但過(guò)度自噬并未提高OXPHOS 功能，該結(jié)果也證明適度自噬能夠應(yīng)對(duì)應(yīng)激，而過(guò)度自噬將損害線粒體網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)中、高劑量四君子湯治療后線粒體維持基礎(chǔ)自噬水平，推測(cè)四君子湯可能通過(guò)減少過(guò)度自噬并維持適度自噬進(jìn)而降低ROS 積累，恢復(fù)MMP 并提高線粒體產(chǎn)能，最終導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)正常。

抗凋亡蛋白Bcl-2 及促凋亡蛋白Bax 均為Bcl-2家族成員。Bax 是線粒體應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵組分，受凋亡性刺激后，Bax 形成寡聚體并轉(zhuǎn)位至線粒體膜，增加膜的通透性并導(dǎo)致Cyt-c 釋放，進(jìn)而激活caspase 途徑，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡；而Bcl-2 能夠通過(guò)改變Bax 空間構(gòu)象抑制細(xì)胞凋亡[14，15]。Caspase 3 是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，Cleaved-Caspase3 是其活化形式，而PARP作為應(yīng)激環(huán)境下通過(guò)DNA修復(fù)維持細(xì)胞生存能力的重要因子，是體內(nèi)Caspase-3 的主要剪切靶標(biāo)之一。因此，PARP 的剪切和Cleaved-Caspase 3 活化可作為衡量細(xì)胞凋亡水平的標(biāo)志[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脾氣虛證模型大鼠股四頭肌細(xì)胞凋亡水平升高，經(jīng)中、高劑量四君子湯治療后細(xì)胞凋亡水平下降；不僅如此，高劑量四君子湯還能顯著降低Bax 表達(dá)和ROS 水平。提示脾氣虛狀態(tài)下過(guò)度自噬并未修復(fù)線粒體損傷，不僅如此，線粒體應(yīng)激還導(dǎo)致Bcl-2/Bax失衡，Cytc 釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。經(jīng)中、高劑量四君子湯治療后，Bcl-2/Bax 恢復(fù)平衡，Cyt-c 釋放減少，細(xì)胞凋亡水平下降。

線粒體自噬調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，多種信號(hào)通路可介導(dǎo)不同種類的自噬過(guò)程，如PINK1/Parkin 依賴的膜電位降低引起的線粒體自噬；與細(xì)胞死亡有關(guān)的蛋白Bnip3/Nix 介導(dǎo)的線粒體自噬及FUNDC1 參與缺氧介導(dǎo)的線粒體自噬[17]。但何種機(jī)制介導(dǎo)脾氣虛骨骼肌自噬紊亂，四君子湯是否直接調(diào)控線粒體自噬又是怎樣誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還并不清楚。因此，這也是本課題組后續(xù)研究重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域。本研究認(rèn)為，四君子湯可能通過(guò)抑制過(guò)度線粒體自噬，維持適度自噬改善線粒體應(yīng)激，降低細(xì)胞凋亡水平治療脾氣虛四肢不用。