多花黃精種子結(jié)構(gòu)與休眠及萌發(fā)的關(guān)系研究

2史素影葛盼盼邢世海2韓榮春2吳振東周 安2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,合肥 230012;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護與開發(fā)研究所,合肥 230012;3.安徽省青陽縣九華中藥材科技有限公司，安徽 青陽 242800)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)為《中國藥典》[1]2015年版收錄的黃精藥材的原植物之一，具補氣、養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效，用于脾胃氣虛，體倦乏力，精血不足等癥,黃精藥材具藥用價值的同時兼食用價值。目前，多花黃精的無性繁殖主要以根莖繁殖為主，有性繁殖主要以種子繁殖為主。根莖繁殖的產(chǎn)量高，一年即可出苗，但其繁殖系數(shù)低，損耗大量根莖，長期使用根莖繁殖方式會造成種質(zhì)退化，病蟲害加劇。種子繁殖可節(jié)約根莖資源，其繁殖系數(shù)高[2,3]，但種子存在休眠現(xiàn)象，導(dǎo)致種子繁殖困難及成本太高等實際問題。加快多花黃精種子繁殖速度，已成為亟需解決的問題。

目前，認(rèn)為種子休眠主要為外部的種皮及胚乳等的機械阻礙和內(nèi)部的激素水平調(diào)控等[4-6]。多花黃精種子存在休眠現(xiàn)象，種胚存在生理后熟，屬于綜合休眠[7]即結(jié)構(gòu)性和生理性并存的休眠類型。打破機械休眠、處理種子的方式有機械處理、激素處理、化學(xué)試劑處理、層積處理等方法[7]。本實驗通過對多花黃精種子解剖學(xué)結(jié)構(gòu)的研究，進一步采用機械和化學(xué)試劑處理種皮等方法，深入探究多花黃精結(jié)構(gòu)性休眠機理，提高其種子發(fā)芽率和出苗率，以期對多花黃精的繁育種植提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

試驗材料于2017年7月采自安徽省青陽縣栽培基地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為黃精屬多花黃精(P.cyrtonemaHua)。

設(shè)備與試劑為蘇丹黑B(源葉生物)；番紅、固綠(南京奧多福尼)；碘液(海博生物)；間苯三酚(阿拉丁)；蘇丹三(源葉生物)；番紅固綠制片(洛陽甲子制片)；E 5系列生物顯微鏡(寧波舜宇)；SZ 780連續(xù)變倍體視顯微鏡(重慶奧特)；AX 324 ZH型電子天平(奧豪斯)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊)；GHP-300型智能光照培養(yǎng)箱(上海三發(fā))。

1.2 實驗方法

1.2.1種子處理

取多花黃精果實，自然發(fā)酵成熟后清水漂洗，種子與果肉剝離。種子洗凈陰干，于濕砂中4 ℃保存。

1.2.2種子基礎(chǔ)特性測定

統(tǒng)計果實含種子數(shù)：測定種子大小(0.5 mm刻度直尺，種臍與種阜直線距離為縱徑，相垂直距離為橫徑)；采用百粒重法測定種子千粒重；常規(guī)紅墨水染色法測定種子胚的生活力；直接烘干法測定種子含水量：隨機取種子20粒，平行3次，將種子烘干至18 h后測定質(zhì)量，間隔1 h測定至恒重。

吸水率測定：隨機取種子50粒，平行3次，加水吸脹，置于25 ℃恒溫箱中，定期取出，濾紙吸干種子表面水分，至恒重，計算吸水率(每8 h和每1 h各1組實驗)。

1.2.3種子結(jié)構(gòu)特征的研究

1) 種子微性狀。隨機取種子若干，體視顯微鏡下觀察種子表面特征、橫切面、縱切面，記錄并拍照。

2) 種子顯微結(jié)構(gòu)特征。隨機取種子若干，徒手切片，電子顯微鏡下觀察種子胚、胚乳細胞及種皮結(jié)構(gòu)，組織化學(xué)染色法(碘液、蘇丹三、蘇丹黑、番紅固綠、間苯三酚-鹽酸)鑒別種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)[8,9]，記錄并拍照。

1.2.4種子發(fā)芽率實驗

1) 機械法去除種皮。將種子處理成全剝皮和去種臍，用5%NaClO消毒20 min。培養(yǎng)皿中放置滅菌濾紙，無菌水稍潤濕，每皿放置已消毒的各處理種子30粒，各組3次重復(fù)，實驗均要求無菌操作定期澆滅菌水，空白組為無處理的完整種子。培養(yǎng)條件為25 ℃遮光處理，1個月后統(tǒng)計發(fā)芽率。

2) 化學(xué)試劑處理種皮。硫酸處理種皮：將多花黃精種子用10%、45%、60%硫酸分別浸泡1 min，10 min，30 min，60 min，90 min，處理期間不斷攪拌，處理后用無菌水沖洗。將濾紙平鋪于培養(yǎng)皿中，每皿30粒，每個處理3次重復(fù)，無菌水沖洗的未經(jīng)硫酸處理的種子作為對照。培養(yǎng)條件為25 ℃暗處理，2個月后統(tǒng)計發(fā)芽率。

NaOH處理種皮：將多花黃精種子用10%、45%、75%NaOH分別浸泡30 min，60 min，90 min，120 min,150 min，處理期間不斷攪拌，種子處理后用無菌水沖洗。將濾紙平鋪于培養(yǎng)皿中，每皿30粒，3次重復(fù)，無菌水處理的種子作為對照。培養(yǎng)條件同上，2個月后統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

發(fā)芽率數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 25軟件進行方差分析及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的基礎(chǔ)特性

多花黃精漿果球形，表面具棱，3條，為腹縫線，沿中軸線徑向延伸，表面眾多點狀斑點。果實所含種子為7～8個，極差為2～14個。據(jù)此結(jié)果可測算多花黃精株均結(jié)實數(shù)約為250個。多花黃精種子粒徑大小為(3.950±0.422)mm×(3.683±0.404)mm。鮮種子千粒重為(25.036±2.117)g。經(jīng)常規(guī)紅墨水染色法測定，多花黃精種子的生活力為(83.33±5.51)%。種子經(jīng)濕砂貯存，生活力較高，說明該種子質(zhì)量較好。多花黃精鮮種子含水量為(45.29±2.76)%。

吸水率測定結(jié)果見圖1。如圖1 A，多花黃精種子在1 d中的吸水趨勢持續(xù)上升，在第1小時內(nèi)漲幅最大，之后緩慢上升，而達到第12小時后，仍在呈上升趨勢，說明種子仍未達到飽和吸脹程度。如圖1 B，種子在前16 h內(nèi)吸水速度迅猛，在8 h內(nèi)達到最高，16 h內(nèi)繼續(xù)吸脹，但在16～24 h有下降趨勢，這可能和種子在此時的呼吸作用有關(guān)。在56～64 h間出現(xiàn)第2次下降趨勢，在80 h后漸趨于平穩(wěn)。由圖1 B可知，多花黃精種子吸水時間大約為4 d，吸脹速度緩慢。

圖2 多花黃精不同種皮與干燥種子

圖3 多花黃精種子微性狀

2.2 種子結(jié)構(gòu)特征的研究

2.2.1種子微性狀

多花黃精種子多為不規(guī)則卵球形，似綠豆大小，大多種子表面平整，部分種子表面有棱，呈棱狀不規(guī)則卵球形。種皮多呈淡黃色，少數(shù)淺綠(圖2 A,B),干種子種皮皺縮，呈干癟狀，體積較小，顏色較深(圖2 C)。

多花黃精種子外部結(jié)構(gòu)主要有種臍、種阜及種皮，種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)為棒狀胚結(jié)構(gòu)和胚乳(圖3)。大多鮮種子表面平整光滑，種皮淡黃色，種臍呈小黑圓點狀，平整，不明顯突出(圖3 E)。干種子種皮皺縮呈深黃色，種臍突出呈深褐色，部分胚及胚乳清晰可見(圖3 G)。種臍與種阜相對，胚位于種臍內(nèi)側(cè)凹入。多花黃精種的胚均呈棒狀結(jié)構(gòu)，新鮮種胚呈微乳白色，干燥種胚呈乳白色，多數(shù)皺縮狀。胚乳大面積包裹胚，胚與胚乳間存在間隙。從種臍縱切可見，種胚與胚乳呈分離狀態(tài)。胚所在位置呈凹槽，被胚乳整體包裹，胚占據(jù)種子縱徑約1/2的位置。

2.2.2種子顯微結(jié)構(gòu)特征

多花黃精種子結(jié)構(gòu)完整，經(jīng)顯微觀察由外到內(nèi)結(jié)構(gòu)為：角質(zhì)層、木質(zhì)化種皮、柵狀細胞、胚乳細胞和種胚，后含物有脂肪油、蛋白質(zhì)結(jié)晶、糊粉粒。種皮是由一層木質(zhì)化的死細胞組成，最外層為一層薄膜狀的角質(zhì)層構(gòu)成，連接種皮與胚乳中間一層為柵狀細胞依次排列，向內(nèi)為大面積的胚乳細胞相互連接，胚為單一的胚細胞構(gòu)成(圖4 H～M)。

圖1 多花黃精種子日間吸水率(A)、間隔8 h的多花黃精種子吸水率(B)

種皮經(jīng)染色見由明顯的單細胞構(gòu)成，無核，無細胞壁，內(nèi)含大量脂肪類物質(zhì)(圖4 L)。胚乳經(jīng)染色，可見內(nèi)部分布大量脂肪油(圖4 O)。種皮、胚乳、胚內(nèi)部均含有大量的脂肪油狀物質(zhì)?？v切面中胚乳細胞呈射線延伸至種胚，種胚位列中軸線上偏向一側(cè)。橫切面中，胚乳細胞放射狀延伸至中心，胚位列中心(圖4 N,O)。

注：H為蘇丹三染縱切面;I:番紅固綠染縱切面;J為稀碘液染縱切面;K為蘇丹三染種胚縱切面;L為蘇丹黑染種皮;M為蘇丹三染縱切面;N為間苯三酚鹽酸染縱切面;O為蘇丹三染橫切面：①胚乳細胞；②角質(zhì)層；③木質(zhì)化種皮；④蛋白質(zhì)結(jié)晶與糊粉粒；⑤柵狀細胞；⑥脂肪油。

2.2.3發(fā)芽率實驗

1) 機械法處理種皮。如圖5所示，除種皮的種子發(fā)芽率較高，除種臍的發(fā)芽率與空白組相差不大。由t檢驗可得，p<0.05,說明處理方式對發(fā)芽率的影響存在顯著差異。因此，解除種皮束縛是提高種子萌發(fā)率的關(guān)鍵。

2) 化學(xué)試劑處理種皮。由圖6可得，10%硫酸處理1 min平均發(fā)芽率最高，且10%處理組的發(fā)芽率均較空白組明顯提升。45%硫酸處理1 min時的發(fā)芽率也有明顯提升。60%硫酸處理總體發(fā)芽率較低。45%和60%處理90 min均出現(xiàn)萌發(fā)極度抑制現(xiàn)象，發(fā)芽率為0。

圖5 機械法除種皮的發(fā)芽率

圖6 不同濃度硫酸處理的發(fā)芽率

據(jù)方差結(jié)果(表1)顯示，硫酸的濃度和時間均對發(fā)芽率有極顯著差異，p<0.01，分析結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，硫酸的濃度和時間對種子萌發(fā)均具有顯著影響，且使用10%硫酸處理1 min時可有效提高多花黃精種子的發(fā)芽率。

表1 不同濃度硫酸處理方差分析

NaOH處理種皮：由圖7可知，使用不同濃度NaOH處理種子對其發(fā)芽能力具抑制現(xiàn)象。使用10%的NaOH處理種子時發(fā)芽抑制現(xiàn)象相較其他處理組不太明顯，最高發(fā)芽率未達10%。而越高濃度的處理越長時間時，種子萌發(fā)抑制越明顯。由方差分析(表2)結(jié)果得：濃度因素中，F(xiàn)=3.659，p<0.05；時間因素中，p<0.01，因此，說明濃度對發(fā)芽率的影響存在顯著性差異，時間對發(fā)芽率的影響存在極顯著差異性。NaOH的濃度與時間對多花黃精種子發(fā)芽率均具有顯著性影響，結(jié)果證明NaOH不能提高多花黃精種子發(fā)芽率。

圖7 不同濃度NaOH處理的發(fā)芽率

表2 不同濃度NaOH處理方差分析

3 討 論

3.1 多花黃精形態(tài)特征與萌發(fā)的關(guān)系

研究表明，種子的萌發(fā)與其外部形態(tài)及生長的環(huán)境有直接的聯(lián)系[10]。種子成熟后因其不易受到風(fēng)力及外力影響自行脫落至土壤，其表面積較大以增大土壤接觸可充分吸收水分和其他所需養(yǎng)分，并潛伏于土壤中吸取養(yǎng)分維持種子活力，等到環(huán)境條件適宜再啟動萌發(fā)[10]。多花黃精種子為近球形，千粒重可達25 g以上，體積較大，存在休眠且萌發(fā)率低；野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多花黃精多生長在腐殖質(zhì)土壤中，喜陰濕，種群多群聚生長，這可能和多花黃精種子體積較大，難以隨風(fēng)力自由散開繁殖有關(guān)；同時，多花黃精與土壤接觸面大等到營養(yǎng)水分充足且環(huán)境適宜時容易萌發(fā)。因此，多花黃精種子的形態(tài)特征與環(huán)境因素均有可能影響其種子的萌發(fā)。

研究表明，種皮的透水性影響種子的萌發(fā)[11-13]。張玉翠等[11]研究認(rèn)為，黃精種子存在吸水緩慢的特性，從而影響其呼吸及代謝酶的啟動。多花黃精種子吸脹時間較長，種皮結(jié)構(gòu)同樣存在吸水障礙，這與該研究中使用硫酸可以有效提高種子萌發(fā)的結(jié)論吻合，可以證明其種皮機械障礙較大，很大程度上阻礙種子萌發(fā)。

3.2 多花黃精種子結(jié)構(gòu)與萌發(fā)的關(guān)系

種皮結(jié)構(gòu)將是影響發(fā)芽率的關(guān)鍵。種皮由一層角質(zhì)層、木質(zhì)化種皮細胞構(gòu)成，其中，種皮上附有大量的脂肪油類物質(zhì)。周健研究表明，種皮中的角質(zhì)層、柵欄細胞、種臍等特殊結(jié)構(gòu)對種子吸脹過程有影響[14]。黃精種子與多花黃精種子結(jié)構(gòu)相似，研究表明，黃精種子的種皮具有木質(zhì)化的細胞層，是阻礙種子吸脹的主要原因。種子的吸水能力與萌發(fā)緊密相關(guān)，吸水是種子萌發(fā)的起始階段[11]。研究表明，種子內(nèi)的胚乳細胞結(jié)構(gòu)[11]、脂類物質(zhì)[14]對種子萌發(fā)均有影響。多花黃精種子內(nèi)胚乳細胞緊密連接，脂類物質(zhì)大量分布，與其難以萌發(fā)緊密相關(guān)，其在種胚和種皮上也有分布，且胚內(nèi)部的脂類物質(zhì)排列致密，這與阻斷種胚吸收營養(yǎng)物質(zhì)及吸水并啟動相關(guān)呼吸酶的表達也有關(guān)聯(lián)。多花黃精種子胚乳最外層?xùn)艡跔畹臇艩罴毎?，依次排列致密，?nèi)含多數(shù)擬晶體，其特殊的結(jié)構(gòu)與柵欄細胞相似，故認(rèn)為柵狀細胞可能與阻礙其吸水及啟動萌發(fā)等機制有關(guān)。

3.3 種皮處理對多花黃精種子休眠與萌發(fā)的關(guān)系

種子休眠有2種因素：機械(即種皮及胚乳)障礙和內(nèi)部激素調(diào)控[4-6]。從多花黃精的種子結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，種臍內(nèi)側(cè)即為種胚所在的位置。但在研究中發(fā)現(xiàn)，全部去除種皮的種子發(fā)芽率要顯著高于只去除種臍處種皮的發(fā)芽率，故種胚吸水并不能啟動萌發(fā)的機制，因此，多花黃精種子在解除休眠過程中，需要胚乳細胞吸收營養(yǎng)供給胚的發(fā)育成熟，其種胚不存在休眠，休眠主要是胚之外的因素引起，張玉翠等也有一致的觀點[11]。胚乳在種子中起著支撐的作用，并提供胚維持生命力所需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時對胚的生長有一定的控制作用。程秋香認(rèn)為，胚在打破自身休眠狀態(tài)過程中不斷發(fā)育成熟，會釋放信號到胚乳細胞并對胚乳自身貯藏的物質(zhì)產(chǎn)生降解，并認(rèn)為胚完成自身發(fā)育的過程同時會弱化胚乳自身的效應(yīng)，是個雙向啟動的機制[15]。

大多硬實種子均用酸蝕或機械處理[16-18]，均能有效提高種皮的機械障礙，從而解決其存在的結(jié)構(gòu)性休眠問題從而提高萌發(fā)率。研究者發(fā)現(xiàn)種子經(jīng)酸蝕后，種皮結(jié)構(gòu)逐漸疏松，角質(zhì)層變薄，木質(zhì)化結(jié)構(gòu)變得疏松[17]，出現(xiàn)種皮炭化變黑現(xiàn)象，從而種子可以解除種皮障礙而較快吸水。在多花黃精種子酸蝕過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度酸處理越長時間種皮上出現(xiàn)炭化變黑的現(xiàn)象，與上述作者研究的結(jié)果一致[17]。在本實驗中，使用酸處理多花黃精種子種皮時，其種皮結(jié)構(gòu)和內(nèi)部的胚乳細胞和脂肪油可能都會發(fā)生這一系列的裂解變化，從而可以有效提高其種子的發(fā)芽率，打破種皮障礙導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)性休眠。直接機械處理種皮后，可以直接解除種皮帶來的阻礙。

本實驗中，使用NaOH處理多花黃精種子后，均表現(xiàn)出抑制萌發(fā)效應(yīng)。研究表明，植物過度攝取Na+、K+等鹽離子，會使植物細胞內(nèi)的酶喪失活性，同時會影響質(zhì)膜的選擇透過性，損害細胞膜的運作，對植物機體產(chǎn)生不利影響，同時，植物細胞在高鹽高pH值條件下也不宜生存[19,20]。李欣瑞等研究發(fā)現(xiàn)，對武陵假儉草種子以50 g·L-1NaOH溶液處理5 min發(fā)芽率最高，低濃度的NaOH溶液可以增加種皮纖維素的溶脹，增加種皮的吸水性并有利于內(nèi)部抑制物質(zhì)外排[21]。本研究中多花黃精種子種皮的結(jié)構(gòu)由木質(zhì)化和角質(zhì)等組成，其成分主要為木質(zhì)素和纖維素[22]，與上述種皮結(jié)構(gòu)不太一致，但成分相似；可認(rèn)為多花黃精種子使用強堿處理后可能增加了種皮的溶脹，堿液極易進入胚乳及胚內(nèi)，細胞內(nèi)產(chǎn)生不適胚生長發(fā)育的pH條件，從而種子出現(xiàn)抑制萌發(fā)現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

由微性狀觀察，多花黃精種子結(jié)構(gòu)完整，包括種子外部結(jié)構(gòu)為種皮、種臍、種阜，內(nèi)部結(jié)構(gòu)為胚乳和胚；顯微結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次為角質(zhì)層、木質(zhì)化種皮、柵狀細胞、胚乳細胞、蛋白質(zhì)擬晶體和糊粉粒、脂肪油、胚細胞及胚內(nèi)部的脂類物質(zhì)。由種子吸水規(guī)律可得種子具有吸水障礙，將種皮破除進行驗證，全部去除種皮的種子發(fā)芽率較高，去除種臍種子及無處理種子的發(fā)芽率幾乎為0。此結(jié)果表明，種皮是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素。使用硫酸和NaOH處理種子，10%硫酸處理1 min為最佳處理方式，可有效打破休眠狀態(tài)，并提高萌發(fā)率，NaOH處理后抑制種子萌發(fā)；因此，本實驗證明多花黃精種子屬于結(jié)構(gòu)性休眠類型，短時間內(nèi)使用酸可有效打破其種皮的機械障礙，而使用堿液不利于多花黃精種子的萌發(fā)。