兩種嶺南濕熱證小鼠模型腸道菌群動態(tài)變化的研究＊

陳 弋，王 琛，徐秋英，林興棟，皮立宏，吳智兵，謝淑瑩

（1. 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 廣州 510378；4. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 廣州 510405；5. 廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心 廣州 510405）

濕熱證是嶺南地區(qū)常見的證候類型。目前在該研究領(lǐng)域，使用細菌[1-2]、內(nèi)毒素[3]、病毒[2,4]、脂多糖（LPS）[5-6]等致病因素，配合飲食、環(huán)境因素影響進行“病證結(jié)合”的復合多因素造模方式已較為成熟，但評判動物模型建立的成功與否，仍以實驗動物能否基本復制臨床濕熱證的癥候為標準，尚缺乏統(tǒng)一的客觀化指標。腸道菌群作為一種非侵入性的生物標志及具有前景性的藥物作用靶點，具有應(yīng)用于嶺南濕熱證的模型研究的潛力。有研究[6]報道，使用LPS作為致病因素建立的濕熱證小鼠模型存在腸道菌群的變化，但尚未見在不同致病因素作用下濕熱證小鼠模型腸道菌群動態(tài)演變的相關(guān)研究。本研究旨在通過對兩種不同致病因素作用下（LPS和大腸桿菌）對建立的嶺南濕熱證小鼠模型腸道菌群動態(tài)變化規(guī)律進行探討，從微生態(tài)角度發(fā)掘客觀化建模指標，既可賦予傳統(tǒng)中醫(yī)證候?qū)W說新的微生態(tài)學內(nèi)容，也為濕熱證的現(xiàn)代證候生物學基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供新的思路，為嶺南濕熱證的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

18-22 g SPF 級雄性 BALB/c 小鼠 52 只，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證明編號為No.44005800010502。

1.1.2 飼料

高脂飼料D12451 由廣東省實驗動物中心提供，總能量4.73 kal/g，脂肪功能比45%，具體組成為：蛋白24%、碳水化合物41%、脂肪24%。普通小鼠飼料由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.3 菌種、藥物及試劑

腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）（鄭州精思威化工有限公司，菌種編號：bio-56937）；麥康凱培養(yǎng)基、LB 固體培養(yǎng)基由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供；蔗糖（廣東廣試試劑科技有限公司，批號：2019010109）；LPS 凍干粉（美國Sigma 公司，貨號：L2880）；糞便基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen 公司，貨號：DP328-02）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)（Takara 公司，貨號：RR047A）；實時熒光定量 PCR 試劑盒 TB Green? Premix Ex Taq ? II(Tli RNaseH Plus)（Takara 公司，貨號：RR820A）；PCR 引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.1.4 主要實驗儀器

RXZ-160型人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅）；麥氏比濁管（廣州環(huán)凱）；NANO DROP 2000超微量紫外/可見分光光度計（美國Thermo）；H1干式恒溫儀（珠海Hema）；2720型熱循環(huán)儀（美國ABI）；7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）；臺式高速冷凍離心機（德國Hittich）；超低溫保存箱（青島Haier）；生物安全柜（HF safe）；LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫(yī)療）。

1.2 方法

1.2.1 菌液及溶液制備

1.2.1.1 大腸桿菌菌液制備

ETEC經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)24 h后采用LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取第5 代菌落至無菌生理鹽水中混懸，參照文獻[2]采用麥氏比濁法測得濃度為109·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用，按0.04 mL·g-1的劑量灌胃感染小鼠，24 h后重復感染一次。

1.2.1.2 LPS溶液制備

將LPS凍干粉用生理鹽水配制為濃度為1 mg·mL-1的溶液，分裝后置于-20℃冰箱保存待用；使用時用生理鹽水將其濃度稀釋為0.1 mg·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用，參照文獻[6]按1 mg·kg-1的劑量腹腔注射小鼠。

1.2.1.3 蔗糖溶液制備

將蔗糖結(jié)晶粉末用超純水配制成20%蔗糖溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 動物分組及造模方法

實驗小鼠在ABSL-2實驗室中適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，采用隨機數(shù)字表法分為6 組，分別為：正常組（A1）、正常環(huán)境+ETEC 組（A2）、正常環(huán)境+LPS 組（A3）、濕熱環(huán)境組（B1）、濕熱環(huán)境+ETEC 組（B2）、濕熱環(huán)境+LPS 組（B3）。A 組（A1、A2、A3）置于ABSL-2 實驗室內(nèi)（室溫21-24℃，濕度55%左右），飼喂SPF 級普通飼料，自由攝食及飲水。B 組（B1、B2、B3）置于人工氣候箱（溫度30.5-31.5℃，濕度85%-95%），每日連續(xù)10 h，飼喂高脂飼料，自由攝食及飲用20%蔗糖溶液，連續(xù)造模20天。造模第20 天，A2、B2 組小鼠灌服大腸桿菌菌液，24 h 后重復感染 1 次；A3、B3 組小鼠腹腔注射 LPS 溶液。小鼠灌胃或腹腔注射后繼續(xù)每日放于人工氣候箱內(nèi)10 h，密切觀察10天。

1.2.3 模型評價及觀察指標

從造模開始觀察并記錄模型小鼠的體重、進食量、精神狀態(tài)、活動度、形體、被毛、爪、尾、肛門情況、二便性狀等癥狀、體征變化，參照文獻[6-8]判斷濕熱證小鼠模型建立成功與否，并按癥狀無、輕、中、重程度分別記為0、1、2、3分（見表1）。每隔5天統(tǒng)計小鼠的癥狀積分。

表1 嶺南濕熱證小鼠模型癥狀積分明細

1.2.4 樣本的采集

1.2.4.1 小鼠糞便樣品的采集

采用逼迫法收集干凈的小鼠糞便至無菌EP 管中，每管收集180-200 mg 并置于冰中運輸，于糞便采集時間起2 h 內(nèi)存于-80℃冰箱。采集時間點為：造模前，造模第5、10、15、20、21、22、25、30 天。糞便采集應(yīng)于腹腔注射執(zhí)行之前。

1.2.4.2 結(jié)腸標本的采集

造模第30天收集糞便后處死小鼠，取小鼠結(jié)腸組織，從回盲部下1 cm 處開始剪取，剪出0.6-0.7 cm，用冰鹽水小心清除腸內(nèi)容物后快速泡于4%多聚甲醛中常溫保存。剩余結(jié)腸組織用預(yù)冷生理鹽水清洗后在濾紙中吸掉殘余液體，于-80℃冰箱中保存待檢。

1.2.5 檢測指標

1.2.5.1 實時熒光定量PCR檢測腸道菌群

收集小鼠不同時間點的糞便后，按照糞便基因組DNA 提取試劑盒說明書提取菌群DNA，存于-20℃冰箱備用。查閱相關(guān)文獻[6,9]獲取引物序列，并在BLAST基因庫內(nèi)比對引物特異性。各引物序列靶基因為16S rDNA，引物序列及PCR擴增片段長度見表2。

按照PCR 試劑盒說明書配制20 μl 反應(yīng)體系，以TB Green 為熒光信號采用兩步法擴增目的基因，具體程序為：預(yù)變性 95℃ 30 s，PCR 反應(yīng) 95℃ 5 s、60℃ 34 s，循環(huán) 40 次；熔解曲線階段 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。收集熒光信號后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，由ABI 7500 Software v2.0.6 計算每孔CT值，根據(jù)CT 值采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達含量。每個樣品設(shè)置2個復孔，實驗結(jié)果重復3次。

1.2.5.2 結(jié)腸病理切片觀察形態(tài)學改變

小鼠結(jié)腸組織經(jīng)多聚甲醛固定后予脫水包埋，制作HE染色切片，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的形態(tài)學變化。

1.2.5.3 實時熒光定量PCR檢測結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）基因表達

取50-100 mg 結(jié)腸標本液氮研磨，加入Trizol、氯仿、異丙醇等提取RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒去除基因組DNA后，冰上配制20 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA模板，存于-20℃冰箱備用。以GAPDH為內(nèi)參進行PCR擴增，檢測各組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平。具體反應(yīng)程序同腸道菌群的PCR反應(yīng)程序，擴增引物序列見表3。每個樣品設(shè)置3個復孔，實驗結(jié)果重復3次，以2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

1.2.6 統(tǒng)計學方法

本實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)類型均為計量資料，運用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量資料的方差分析方法，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)無須校正，直接進行主體內(nèi)效應(yīng)檢驗（一元方差分析）；不滿足球形假設(shè)則用Greenhouse-Geisser 校正自由度，采用多變量檢驗分析，參考一元方差分析結(jié)果；當不同處理組與不同時間上的差別有統(tǒng)計學意義時，運用Bonferroni 法進行多重比較。非重復測量的數(shù)據(jù)，若滿足方差齊性，采用單因素方差分析；不滿足方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物數(shù)量

52 只 BALB/c 小鼠，其中 B2 組 2 只因操作不當分別于造模第22、23 天死亡，死亡率為3.85%，本實驗最終納入50只進入結(jié)果分析。

表2 腸道菌群實時熒光定量PCR特異引物

表3 TNF-α、IL-6 實時熒光定量PCR特異引物

2.2 一般情況觀察

造模前各組小鼠一般情況良好，反應(yīng)靈敏，皮毛柔順有光澤，致密整齊且緊貼身體，糞便黑褐色呈麥粒狀。隨著實驗開展，B 組（B1、B2、B3）小鼠進食減少，其糞便總體較A 組（A1、A2、A3）濕軟臭穢，置于濾紙上可見糞便周圍有少量水痕，部分小鼠糞便夾有白色黏稠液體。造模第20 天各組給予相應(yīng)的致病因子后，A3、B3 組小鼠精神萎靡不振，喜扎堆，明顯嗜臥懶動，聳毛，被毛無光澤，納呆，黏液便，個別小鼠出現(xiàn)便溏；A2、B2 組小鼠活動度減少，被毛無光澤，納呆，亦可見糞便濕軟及黏液便，但精神狀態(tài)優(yōu)于A3、B3 組，B2 及B1 組部分小鼠在排便過程中出現(xiàn)肛門脫垂現(xiàn)象。3 天后 A2、A3 組小鼠恢復正常，B2、B3 組小鼠除精神狀態(tài)、活動度好轉(zhuǎn)外，糞便濕軟、黏液便等癥狀仍持續(xù)存在。從造模第25 天開始，B 組小鼠逐漸出現(xiàn)耳紅、爪紅及肛門紅腫充血，耳紅、爪紅現(xiàn)象以B1組最為明顯。根據(jù)現(xiàn)有實驗小鼠的濕熱證證候診斷標準，至第25 天B2、B3 組建模成功，濕熱癥狀持續(xù)3 天以上。至實驗結(jié)束，B2、B3 組小鼠仍有糞便濕軟、黏液便現(xiàn)象，以B2組更為明顯。

2.3 癥狀積分

小鼠癥狀積分隨著時間變化（F=162.308，P＜0.01），不同時間小鼠癥狀積分因干預(yù)因素的變化而變化（F=3.859，P＜0.01），各組積分不全相同（F=87.34，P＜0.01），總體 A 組與 B 組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），B2、B3 組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.099＞0.05）。見表 4、圖 1，與 A1 組相比，B 組在造模前 10 天癥狀積分小幅增高（P＜0.05）后下降至正常水平（P＞0.05），給予相應(yīng)的致病因子后B2、B3 組小鼠癥狀積分升高且后續(xù)積分在較高水平波動（P＜0.05）。隨著實驗的進展，B1 組小鼠的癥狀積分也逐漸上升（P＜0.05）。A3 組在攻毒后癥狀積分可達高峰（P＜0.05），但3 天后即降為0分并維持在低水平（P＞0.05）。

表4 不同時間段各組小鼠癥狀積分（分）

圖1 各組小鼠癥狀積分變化

2.4 腸道菌群實時熒光相對定量PCR檢測結(jié)果

2.4.1 各組間同種細菌變化趨勢的比較

2.4.1.1 大腸桿菌屬

各組大腸桿菌屬含量隨著時間變化差異有統(tǒng)計學意義（F=72 967.12，P＜0.01），且從不同時間點上測得的含量因干預(yù)因素的不同而改變差異有統(tǒng)計學意義（F=12.246，P＜0.01），總體不同組別大腸桿菌屬含量不同（F=81.778，P＜0.01）。見表5，圖2-1，B組小鼠糞便中大腸桿菌屬含量先降低后增多，在造模第20 天予相應(yīng)的致病因素后A2、B2、B3 組大腸桿菌屬含量顯著增多（P＜0.05），在造模第25 天后逐漸降低。

2.4.1.2 擬桿菌屬

各組擬桿菌屬含量隨著時間變化差異有統(tǒng)計學意義（F=9 416.097，P＜0.01），且從不同時間點上測得的含量因組間干預(yù)因素的不同而改變（F=77.748，P＜0.01），總體不同組別擬桿菌屬含量不同（F=52.765，P＜0.01）。見表6、圖2-2，B2、B3 組在第20 天予致病因子干預(yù)后，在造模第22 天擬桿菌屬含量升高達峰（P＜0.05），第25 天可回落至正常水平（與A1組相比P＞0.05）。

表5 不同時間點各組小鼠糞便樣品中大腸桿菌屬實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

圖2 各組小鼠糞便大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬含量變化

2.4.1.3 腸球菌屬

各組腸球菌屬的含量隨著時間變化差異有統(tǒng)計學意義（F=8 491.909，P＜0.01），且從不同時間點上測得的含量隨著各組之間處理方式的改變而改變（F=13.06，P＜0.01），不同組別腸球菌屬含量總體而言不同（F=814.994，P＜0.01），B 組腸球菌屬含量高于 A 組（P＜0.05）。見表7，圖2-3，從造模第1天起，B組腸球菌屬含量逐漸增多（P＜0.05），在第20天予致病因子后，B2、B3組腸球菌屬含量均下降，第22天降至最低，第25天又出現(xiàn)一峰值，二者變化趨勢大致相同，B3組變化幅度更大。

2.4.1.4 梭菌屬

各組梭菌屬含量隨著時間變化差異有統(tǒng)計學意義（F=3 747.116，P＜0.01），且從不同時間點上測得的含量隨著各組之間處理方式的改變而改變（F=6.752，P＜0.01），不同組別梭菌屬含量不全相同，總體B1 組梭菌屬含量最高（P＜0.05）。見表8、圖2-4，對比所測其他細菌，各組梭菌屬的含量變化相對較小，B1組在第25天建模成功后出現(xiàn)上升趨勢。

表6 不同時間點各組小鼠糞便樣品中擬桿菌屬實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

表7 不同時間點各組小鼠糞便樣品中腸球菌屬實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

表8 不同時間點各組小鼠糞便樣品中梭菌屬實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.4.2 各組內(nèi)不同細菌變化情況的比較

以小鼠糞便中所測各細菌造模前的基因含量為參照，將各細菌不同時間點的增長倍數(shù)在各組中所占的百分比繪制成堆疊圖，可直觀地反映各組不同時間點不同細菌的變化情況（見圖3）。A1 組菌群雖有波動，但各菌群增減總體保持穩(wěn)定。A2、A3 組在造模第20 天之前（包括第20 天）各菌群的變化也維持動態(tài)平衡的狀態(tài)，給予相應(yīng)的致病因子后，A2 組在第21、22天，糞便中大腸桿菌屬異常增多，第25、30天菌群變化情況逐漸恢復正常；A3組第22天也以大腸桿菌屬異常增長為主。B組從造模開始，腸球菌屬增長即占優(yōu)勢。在沒有外源性ETEC 或LPS 感染的B1 組，腸內(nèi)條件致病菌變化情況以腸球菌屬異常增多為主；B2、B3組在第21、22天出現(xiàn)大腸桿菌屬、擬桿菌屬特異性增多。

2.5 結(jié)腸HE染色切片觀察

見圖4-1、圖4-2，A1 組結(jié)腸黏膜上皮細胞排列致密整齊，固有層中大腸腺密集，含有大量的杯狀細胞，黏膜下層結(jié)締組織無明顯病理性改變。與A1組相比，A2組結(jié)腸黏膜上皮細胞增生變形，其余組織形態(tài)未見明顯變化；A3 組腸黏膜上皮未見明顯改變，固有層中腺體萎縮、數(shù)量減少，固有層及黏膜下層結(jié)締組織疏松水腫。與A1組相比，B組總體腸內(nèi)皺襞減少。B1組腸上皮細胞無顯著改變，黏膜層與黏膜下層結(jié)締組織未見明顯疏松，固有層中可見淋巴小結(jié)及炎細胞浸潤；B2組腸黏膜上皮細胞破碎缺損，固有層中可見淋巴小結(jié)及炎細胞浸潤，黏膜下層結(jié)締組織疏松水腫明顯；B3組腸黏膜上皮見空泡樣變性，固有層與黏膜下層結(jié)締組織疏松，固有層中可見炎細胞浸潤及淋巴濾泡形成。

2.6 結(jié)腸TNF-α、IL-6基因表達量

見表9、圖5，與A組及B1組相比，B2、B3組TNF-α水平升高（P＜0.01），B3 組TNF-α 水平高于 B2 組（P＜0.01）。與A1組相比，B2、B3組IL-6水平升高（P＜0.05），其余組間IL-6水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

圖3 各組小鼠糞便大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬比例變化

表9 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-6實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

圖4-1 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色（×100）

圖4-2 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色（×400）

圖5 各組小鼠結(jié)腸TNF-α、IL-6 mRNA相對表達量

“證候”是中醫(yī)學獨特的存在根基。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的推進，中醫(yī)證候動物模型已成為中醫(yī)藥研究中不可或缺的一部分[10]，標準化的動物模型的復制是研究證候?qū)嵸|(zhì)、促進新藥開發(fā)及提高臨床治療效應(yīng)的關(guān)鍵。濕熱證動物模型的研究始于20世紀80年代[11]。中醫(yī)學認為，本病癥為內(nèi)外合邪致病，薛生白[12]在《濕熱論》中明確指出其發(fā)病機制為“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”。后世研究者多以此為理論基礎(chǔ)，不斷改進造模方法，從使用單一因素造模[11]逐步發(fā)展為“環(huán)境+飲食+生物感染因素”的復合多因素造模方式[2,13-17]，從最初以細菌（大腸桿菌、傷寒桿菌）[11]為感染因素逐步發(fā)展到使用內(nèi)毒素[13]為致病因素，最后引入病毒[2,4,16-17]、LPS[5-6]進行造模。盡管濕熱證動物模型復合多因素造模的方式現(xiàn)已較為成熟，但縱觀該領(lǐng)域的研究，均通過對模型動物的體溫、體重、飲食量、飲水量、舌象、癥狀表現(xiàn)等多種宏觀證候指標進行觀察、評判，以證實動物模型證候模擬成功，但上述指標主觀性均較強，尚缺乏統(tǒng)一的客觀化標準來評價模型建立的成功與否。本研究以此為切入點，使用ETEC 和LPS 模擬外來病邪，氣候箱模擬嶺南地區(qū)濕熱外環(huán)境，高脂高糖飲食模擬嶺南地區(qū)居民嗜好的煎炸、甜食、糯米等肥甘厚膩之品，肥甘飲食損傷脾胃，導致濕熱內(nèi)生而形成內(nèi)濕因素，并將以細菌和細菌內(nèi)毒素的主要活性物質(zhì)LPS為不同致病因素的兩種造模方式進行對比觀察，以發(fā)掘具有證候模型評價潛力的客觀指標。從發(fā)病角度來看，雖然兩種造模方式均為復合多因素造模，既考慮了內(nèi)濕因素，又考慮了外在因素（氣候環(huán)境及濕熱病邪），但以ETEC 經(jīng)口灌胃感染的模型小鼠似乎更加符合中醫(yī)濕熱病邪“從口鼻而入”[12]的發(fā)病機制。從癥狀表現(xiàn)來看，以LPS 為致病因子的模型小鼠精神差、納差、消瘦、聳毛等情況更為嚴重，而以ETEC 為生物致病因子的模型小鼠黏液便、便溏等癥狀更為明顯。但無論哪種造模方式，根據(jù)現(xiàn)有的模型評判標準，兩組模型小鼠（B2、B3 組）造模后均出現(xiàn)了糞便濕軟或黏液便、肛門紅腫充血等“濕熱”癥狀，二者癥狀積分總體無顯著差異，可認為基本復制了嶺南濕熱證動物模型。

隨著人們對腸道微生態(tài)認識的不斷加深，腸道微生態(tài)與人類健康和疾病的關(guān)系已成為臨床醫(yī)學、基礎(chǔ)醫(yī)學及中醫(yī)藥學研究領(lǐng)域的重點和熱點[18-19]。腸道菌群是腸道微生態(tài)的重要組成部分，在宿主免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)吸收、藥物代謝等眾多方面起重要作用[20-22]，在炎癥中亦扮演著重要角色[23]。眾多研究[2-6,16]認為，濕熱證與炎癥密切相關(guān)。腸道菌群與免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)系或許是研究其與濕熱證關(guān)系的重要橋梁。本實驗中除A1 組外，結(jié)腸病理閱片及炎癥指標TNF-α、IL-6的檢測結(jié)果亦支持炎癥的存在。結(jié)合腸道菌群及現(xiàn)代醫(yī)學的角度推測濕熱證發(fā)生炎癥的機制主要包括兩個方面：一方面，高脂高糖飲食及濕熱外環(huán)境引起腸道菌群失調(diào)，激活模式識別受體Toll 樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4），并使腸內(nèi)對 LPS 有解毒作用的堿性磷酸酶釋放減少，導致緊密連接蛋白、黏液及抗菌肽生成減少，腸道黏液層厚度變薄，腸道完整性受破壞，腸道通透性增加，引起細菌移位及代謝性內(nèi)毒素血癥，從而誘發(fā)慢性低度炎癥[23-24]。另一方面，外源性大腸桿菌感染及LPS 的注射進一步激活巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞的TLR4，啟動炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)，通過NF-κB 和MAPK 等信號通路促進炎癥因子TNF-α、IL-6 等的表達釋放，最終導致炎癥發(fā)生[25-26]。從各組的炎癥表現(xiàn)來看，以LPS 為外來致病因素的小鼠較以ETEC 為生物致病因子炎癥反應(yīng)更重（A3 組炎癥反應(yīng)重于 A2 組，B3 組炎癥反應(yīng)重于 B2 組），“飲食+環(huán)境+ETEC/LPS”的復合多因素影響下的模型（B2、B3 組）炎癥因子水平高于單一致病因子（A2、A3組）或“飲食+環(huán)境”（B1 組）影響下的實驗小鼠炎癥因子水平，提示嶺南濕熱證動物模型復合多因素造模的必要性。

在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，腸道菌群中的條件致病菌“功不可沒”。寄生在人體表或體腔的條件致病菌在正常機體中不會致病，在免疫功能不全或其他不健康的特殊條件下則有害[27]，其品種和數(shù)量遠遠多于致病菌，因而更容易發(fā)生細菌移位，誘發(fā)免疫應(yīng)答，導致炎癥、內(nèi)源性感染、組織損傷，最終可能誘發(fā)敗血癥、多器官功能障礙綜合征，甚至死亡[28-31]。本實驗選取大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬和梭菌屬四種人和小鼠腸道內(nèi)最主要的條件致病菌進行研究，由菌群檢測結(jié)果可知，在造模過程中，除A1組菌群變化相對穩(wěn)定之外，其余小鼠均出現(xiàn)了菌群重建，在給予不同的致病因子后所測腸道菌群變化尤為明顯，反映了腸道菌群與濕熱證密切相關(guān)，也表明外來致病因素在濕熱證發(fā)病過程中的重要參與作用。大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬在兩組模型小鼠的菌群變化中趨勢較為一致，其中大腸桿菌屬、擬桿菌屬在建模成功之前提前出現(xiàn)特征性變化。

從大腸桿菌屬的變化來看，B2、B3 組小鼠在造模第21 天即明顯增多并達峰，至第25 天模型成立時雖已呈下降趨勢，但其含量仍高于自身造模前及同時期其他4 組的大腸桿菌量，這與王婷等[6]的研究結(jié)果一致。長期高脂高糖飲食及外源性致病菌、LPS 的干擾使腸道處于炎癥環(huán)境，大腸桿菌作為一種兼性厭氧菌，在炎癥及腸屏障功能受損的情況下，可利用宿主免疫反應(yīng)產(chǎn)生的硝酸鹽作為能量來源，具有顯著的增長優(yōu)勢[32-33]，B3組表現(xiàn)最為明顯。A2組造模第22天大腸桿菌屬也增多，A2、B2 組小鼠糞便中大腸桿菌增多，不排除部分原因是小鼠腸內(nèi)原有菌群的定植抗力將灌胃感染的大腸桿菌從體內(nèi)排出（定植抗力即正常微生物群抵抗外來微生物群生長和長期存在的能力[34]）。B2組由于腸道長期處于慢性炎癥狀態(tài)，使其本土菌群的定植抗力減輕[35]，故B2 組糞便中第21、22 天大腸桿菌屬的量遠不及A2組，可認為B2組排出的外源性致病性大腸桿菌量少于A2組，或者說更多致病性大腸桿菌在B2 組小鼠體內(nèi)定居導致感染。研究[34,36-37]表明，高脂飲食引起腸道菌群改變，緊密連接蛋白表達減少，影響細胞旁通透性，導致腸屏障功能受損，因而增加感染的易感性。從定植抗力這個角度來講，炎癥狀態(tài)下腸道本土菌群定植抗性被破壞，促進病原體生長，導致反復感染、菌群紊亂，與濕熱證“纏綿難愈”的特性不謀而合，可能可將其視為病理機制之一。

擬桿菌屬是人和小鼠腸道中的正常菌群之一，其含量一般比較穩(wěn)定[38]，正常情況下在宿主的免疫、營養(yǎng)代謝等方面起重要作用，但也是一種潛在的致病菌[39-40]。在造模第 20 天給予致病因子后，B2、B3 組擬桿菌屬均特異性增多，在模型成立之前率先提示模型小鼠的病理性狀態(tài)。A2、A3、B1 組擬桿菌屬變化均較為穩(wěn)定，并不同于B2、B3組，提示嶺南濕熱證模型并非外來致病因子與環(huán)境、飲食因素的簡單相加，而是各因素綜合作用的結(jié)果，其具體機制仍有待進一步研究。

腸球菌屬是人和動物腸道內(nèi)一種重要的條件致病菌[41]，現(xiàn)已被認為是腸易激綜合征的潛在生物標志物之一[42]。腸球菌屬具有強抵抗力，本實驗表明在高脂高糖飲食及濕熱環(huán)境影響下（B組）仍可增長。腸球菌屬為革蘭氏陽性菌，在給予B2、B3組致病因子后腸道處于炎癥高點的情況下，可能由于其表面的磷壁酸被機體免疫細胞識別導致一過性降低；而由于其基因組高度的可塑性，易發(fā)生突變，以及具備免疫逃逸、形成生物膜的能力，故腸球菌屬能在惡劣的環(huán)境下生存并促進感染，加重炎癥[43]，表現(xiàn)為在模型成立時其含量顯著增多，這也與王婷等[6]的研究成果是一致的。本實驗中B1組用“高脂高糖飲食+濕熱環(huán)境”影響實驗小鼠，此實為郭氏所創(chuàng)“濕阻證”動物模型的造模方法[44]。飲食不節(jié)，嗜食肥甘厚味，損傷脾胃，而脾主運化，脾失健運則痰濕內(nèi)生，加之潮濕溫暖的外環(huán)境，外濕侵襲，導致濕邪彌漫。在整個實驗過程中，B1組條件致病菌的變化均以腸球菌屬增長為主，故腸球菌屬可能可視為“濕”的特征性菌屬。

對比其他菌屬，梭菌屬在嶺南濕熱證動物模型的建模過程中變化較為穩(wěn)定，在B2、B3 組中無明顯特異性改變，而B1組后期梭菌屬相對含量出現(xiàn)增多。在實驗后期，B 組小鼠逐漸出現(xiàn)耳紅、爪紅等“熱”象，其中以B1 組最為明顯。葉天士在《溫熱論》[45]中指出“然其化熱則一”，表明濕邪最終都可化燥生熱的轉(zhuǎn)歸。在謝婧[46]的研究中，濕熱證熱重于濕組小鼠模型糞便中亦出現(xiàn)梭菌含量增加，而濕重于熱組梭菌含量降低。這些均提示梭菌屬可能可視為“熱”的特征性菌屬。

綜上所述，無論從癥狀表現(xiàn)、菌群變化或中醫(yī)發(fā)病機理的角度看，單一的外來致病因素（細菌或內(nèi)毒素）或僅靠“飲食+環(huán)境”因素造模都不能復制出完整的嶺南濕熱證動物模型。在復合多因素造模原則的指導下，使用ETEC 或LPS 作為外來致病因子均建模成功，這兩種模型小鼠在建模過程中腸道條件致病菌菌群發(fā)生變化，大腸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬的改變均反映了模型小鼠病理性狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展過程，這與小鼠的癥狀表現(xiàn)、結(jié)腸病理及炎癥因子的檢測結(jié)果是相一致的，表明特定腸道菌群在濕熱證客觀評價指標的發(fā)掘上具有廣闊前景。其中，大腸桿菌屬、擬桿菌屬在建模成功之前均出現(xiàn)特征性的增多，或許二者可成為用于濕熱證早期診斷的客觀輔助指標，而腸球菌屬和梭菌屬分別在證候“濕”、“熱”屬性的判斷上具有特殊意義。