犬皮膚真菌病病原分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

黃浩軒

上海八公叔叔網(wǎng)絡(luò)科技有限公司，上海 200000

為了對(duì)犬皮膚真菌病的主要病原進(jìn)行深入了解，落實(shí)真菌分離培養(yǎng)、鑒定極為必要。同時(shí)，要保證使用抗真菌藥物的合理性，就有必要展開藥敏試驗(yàn)。依托這樣的鑒定與試驗(yàn)，能夠篩選出適合犬皮膚真菌病治療的藥物。

1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 試驗(yàn)菌株

隨機(jī)采集了58 個(gè)犬皮膚真菌病的病灶樣本，進(jìn)行真菌分離培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

本次試驗(yàn)使用的儀器設(shè)備包括伍德氏燈、培養(yǎng)皿、電泳儀、壓力蒸汽滅菌器、基因擴(kuò)增儀、低溫離心機(jī)、霉菌培養(yǎng)箱、分析天平、工作臺(tái)、紫外凝膠成像系統(tǒng)。使用的主要試劑與藥品包括制霉菌素標(biāo)準(zhǔn)品、伊曲康唑標(biāo)準(zhǔn)品、酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品、制霉菌素藥敏紙片、伊曲康唑藥敏紙片、西班牙瓊脂糖凝膠、真菌DNA 提取液等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 伍德氏燈檢查

將病犬帶入暗室內(nèi)進(jìn)行伍德氏燈檢查。將伍德氏燈預(yù)熱5 min，使其距離病犬皮膚5 ～10 cm，進(jìn)行照射，記錄患處的熒光反應(yīng)。

2.2 皮膚樣品接種與培養(yǎng)

提取病犬毛發(fā)，將其移入沙氏培養(yǎng)基中接種；使用封口膜對(duì)平板進(jìn)行密封倒置，標(biāo)注編號(hào)、日期等基本信息；放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)皿中。

2.3 病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)確認(rèn)為真菌的菌株進(jìn)行多次的純化處理，獲取穩(wěn)定菌落。每間隔1 d觀察、記錄真菌的生長(zhǎng)狀態(tài)、鏡檢結(jié)果等。

2.4 病原真菌的PCR 鑒定

提取真菌的DNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)與瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物送檢測(cè)序[1]。

2.5 基于紙片擴(kuò)散法的藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)主要過(guò)程如下：培養(yǎng)真菌的增菌，制備真菌懸液，放置抗真菌藥敏紙片，確定NYS、ITC、KET 藥敏片的質(zhì)控指標(biāo)。

3 結(jié)果分析

3.1 病原真菌鑒定結(jié)果

3.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

犬小孢子菌的生長(zhǎng)速度較慢，在第3 天時(shí)，菌落中間部位生長(zhǎng)出白色的長(zhǎng)毛狀菌絲；在第7 天時(shí)，長(zhǎng)出較多的白色菌絲；第14 天時(shí)，菌體中間粉末化，逐漸變?yōu)辄S色粉末。

鏈格孢霉的生長(zhǎng)速度較快，在第3 天時(shí)，菌體中間部位生長(zhǎng)出白色短絨；在第7 天時(shí)，鏈格孢霉基本成熟，且逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?，中間呈現(xiàn)淡粉色；第14 天時(shí)，菌絲占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)皿。

3.1.2 PCR 鑒定結(jié)果

紫光燈條件下，犬小孢子菌的DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物在780 bp 左右形成明亮光帶；鏈格孢霉為580 bp。DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物送檢結(jié)果顯示，培養(yǎng)的真菌為犬小孢子菌（相似性達(dá)到99.29%）與鏈格孢霉（相似性達(dá)到99.42%）。

3.2 紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，犬小孢子菌對(duì)NYS、ITC、KET均具有敏感性，其中，NYS產(chǎn)生的抑菌圈最大最敏感，3 組結(jié)果分別為33.11 mm、29.45 mm、30.38 mm；ITC 產(chǎn)生的抑菌圈最小，結(jié)果分別為20.75 mm、20.38 mm、23.75 mm。

鏈格孢霉對(duì)NYS、ITC 具有敏感性，其中，NYS產(chǎn)生的抑菌圈最大最敏感，結(jié)果分別為30.83 mm、26.65 mm、27.09 mm。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，使用伍德氏燈檢查、PCR 鑒定等方法展開犬常見(jiàn)皮膚病原真菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示：犬小孢子菌的生長(zhǎng)速度較慢，在14 d 時(shí)基本成熟；鏈格孢霉的生長(zhǎng)速度較快，在第7 天基本成熟；犬小孢子菌、鏈格孢霉對(duì)NYS 最敏感，產(chǎn)生的抑菌圈最大。