淺談貝類毒素及其常用檢測技術(shù)

馮春艷，梁瓊，趙曉野，王儒，王婷

海南省食品藥品檢驗所海口分所（?？?570311）

貝類在生長過程中，位置相對固定，因其具有非選擇性濾食習(xí)慣[2]，容易受到海洋環(huán)境中農(nóng)獸藥殘留、重金屬、生物毒素的污染。胡蓉等[1]在海南島近岸海域貝類中的腹瀉性貝類毒素的研究中發(fā)現(xiàn)海南島海域貝類毒素的腹瀉性毒素超標(biāo)率高達(dá)33.68%，而廣東省也曾發(fā)生過因使用有毒貝類引起消費(fèi)者中毒和死亡的事件[3]。海南是沿海省份，貝類產(chǎn)品的人均食用量大，發(fā)生食用貝類產(chǎn)品中毒的概率大大增加，近年來海南貝類養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，關(guān)于海南島海域赤潮的報告也不斷增加[4]，這說明海南貝類養(yǎng)殖的食用安全存在較大風(fēng)險。因此，人們對貝類食用安全性的關(guān)注度日益升高。主要對貝類毒素研究過程中毒素的分類、貝類毒素作用機(jī)理及中毒表現(xiàn)、貝類毒素的高發(fā)季節(jié)、貝類毒素常用檢測方法等方面進(jìn)行闡述。

1 貝類毒素的分類

貝類毒素具有突發(fā)性和廣泛性，是危害較大的海洋毒素之一。根據(jù)其毒性作用機(jī)制可分為麻痹性貝類毒素（PSP）、腹瀉性貝類毒素（DSP）、神經(jīng)性貝類毒素（NSP）和健忘性貝類毒素（ASP）四大類。由于其毒性大、反應(yīng)快、無適宜解毒劑，四類毒素均無特效治療藥。

2 貝類毒素作用機(jī)理及中毒表現(xiàn)

麻痹性貝類毒素（PSP）是一類劇毒的含氯雜環(huán)有機(jī)化合物，毒性與河豚毒素相當(dāng)，一些赤潮生物種，如甲藻類中的亞歷山大藻、膝溝藻屬、原甲藻屬等是PSP的直接生產(chǎn)者。根據(jù)基團(tuán)的相似性，可分為氨甲?；惗舅兀–arbamoyl toxin）、氨甲?；?N-磺基類毒素（N-Sulfo carbamoyl toxin）、去氨甲?；惗舅兀―ecarbamoyl toxin）三大類。其主要是通過對細(xì)胞鈉通道的阻斷，造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙而產(chǎn)生麻痹作用。中毒的主要癥狀為口唇刺痛和麻痹，并擴(kuò)散至面部、脖子、肢端，伴有頭痛、暈眩、嘔吐、腹痛、腹瀉等，嚴(yán)重者會停止呼吸、窒息死亡。

腹瀉性貝類毒素（DSP）是聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物，具有脂溶性，主要來自于自于鰭藻屬（Dinophysis）、原甲藻屬（Prorocentrum）等藻類。DSP由軟海綿酸及衍生物鰭藻毒素-1與鰭藻毒素-3、扇貝毒素（大環(huán)內(nèi)酯化合物櫛膜毒素）、硫化物毒素三種不同的聚醚化合物組成。其主要作用機(jī)制是通過激活腸道細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）介質(zhì)系統(tǒng)而引起水瀉[5]。中毒的主要癥狀是惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等，中毒癥狀可能會持續(xù)3 d，不會留下后遺癥，更不會致命。

神經(jīng)性貝類毒素（NSP）為多環(huán)聚醚化合物，高脂溶性，主要來自于短裸甲藻。其主要作用機(jī)制與麻痹性毒素相似，作用于鈉通道，但其作用位點(diǎn)與石房蛤毒素不同，引起鈉通道維持開放狀態(tài)，從而引起鈉離子內(nèi)流，造成神經(jīng)細(xì)胞膜去極化。中毒的主要癥狀為肌關(guān)節(jié)無力、冷熱感覺顛倒、說話吞吐困難等。

健忘性貝類毒素（ASP）主要來自于軟骨藻酸。其作用機(jī)制是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)紅藻酸受體，導(dǎo)致去極化、鈣的內(nèi)流以及細(xì)胞的死亡。中毒的主要癥狀是頭暈、眼花、短期記憶功能喪失。

3 貝類毒素的高發(fā)季節(jié)

季節(jié)的不同，海水水體溫度、光照條件、pH、海水鹽度等環(huán)境因素變化，進(jìn)而影響藻類種群、數(shù)量和貝類的生理狀態(tài)。PSP與DSP的高發(fā)季節(jié)為秋末和冬季[6]。據(jù)文獻(xiàn)表明，南海中部浮游甲藻密集且主要存在海南島東南部[7]，產(chǎn)PSP的亞歷山大藻在15～20 ℃的低溫下生長較好，且細(xì)胞毒力較強(qiáng)[8-9]，因此甲藻在冬季數(shù)量激增，為貝類提供了豐富的食物資源，這可能是秋冬季海南島近岸貝類體內(nèi)PSP含量增多的主要原因之一，這與李政菊等[6]關(guān)于海南島近岸海域貝類中的麻痹性貝類毒素的研究顯示的海南島近岸海域養(yǎng)殖的主要貝類體重PSPDE檢出率為62.5%結(jié)論一致。還有研究表明，海南島近岸DSP陽性檢出率和超標(biāo)率的最低值均出現(xiàn)在夏季，最高值均出現(xiàn)于冬季[1]。有利瑪原甲藻和D. caudata等是目前已被確定產(chǎn)生DSP的毒藻，海南島海域大量存在有利瑪原甲藻和D.caudata，且浮游植物細(xì)胞密度呈在冬季初期最高，秋季次之，夏季最低的趨勢[10]，這與胡蓉等[1]的研究DSP檢出率達(dá)46.32%，超標(biāo)率達(dá)33.68%，且呈冬季最高，夏季最低的結(jié)論相一致。由于秋末冬初海水溫度、pH、海水鹽度等條件適宜，為有毒藻類的繁殖提供有利的條件，因此夏末至冬季這一時間段為研究海南島近岸貝類PSP和DSP的重點(diǎn)監(jiān)測期。

4 貝類毒素常用檢測方法

4.1 小鼠生物測定法

小鼠生物測定法是將貝類樣品的酸性提取液注射到體質(zhì)量約為20 g的小鼠腹腔中，在24～48 h內(nèi)觀察小鼠的病理效應(yīng)。該方法均可用于ASP、DSP、NSP、ASP的檢測，使用“鼠單位”（Mu）表達(dá)，一個鼠單位（Mu）指一只20 g體質(zhì)量的小鼠在腹腔注射后15 min內(nèi)死亡的毒素最小劑量，PSP的檢出限為4 Mu/g，DSP的檢出限為0.05 Mu/g[11]

該方法檢驗技術(shù)容易掌握，不需要大型精密的儀器和專門的操作人員，被美國分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）確定為檢測PSP的標(biāo)準(zhǔn)方法[11]，但該方法只能確定毒素的有無和大小，不能確定樣品中毒素的成分和結(jié)構(gòu)并準(zhǔn)確定量；且小鼠的死亡時間受小鼠的個性特征、實(shí)驗室的飼養(yǎng)條件、實(shí)驗人員操作技術(shù)、樣品基質(zhì)如游離脂肪酸等內(nèi)源性化合物的影響，導(dǎo)致該方法特異性不高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；此外，小鼠活體實(shí)驗在道德倫理上受到動物保護(hù)主義者的反對，目前很多國家已逐步禁止使用該方法。

4.2 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，將毒素與酶連接，酶與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過分析特定波長的吸收強(qiáng)度對毒素進(jìn)行定性定量分析。主要包括放射免疫分析（EIA）法、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法和競爭性酶免疫分析（EIA）法三種。目前很多公司已經(jīng)研制出酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒并被廣泛應(yīng)用，其檢測貝類毒素的檢出限甚至低至ng/g級，如DSP檢測限為0.1 ng/g、PSP檢測限為0.02 ng/g、NSP檢測限為0.01 ng/g、ASP檢測限為0.5 ng/g[11]。

酶聯(lián)免疫法具有靈敏度強(qiáng)、特異性高、檢測用樣少、操作簡單等特點(diǎn)，不需要大型儀器設(shè)備和專門操作人員，適用于大批量樣本的分析，近年來在海洋生物毒素的快速檢驗中得到廣泛應(yīng)用。但酶聯(lián)免疫法也有一定的缺陷，例如貝類毒素種類繁多，而目前用于檢測貝類毒素的商品化檢測試劑盒種類不全，且免疫反應(yīng)不是針對毒素結(jié)構(gòu)，而是根據(jù)毒素結(jié)構(gòu)的表位進(jìn)行定性定量，因此對于生物基質(zhì)復(fù)雜的毒素，有存在交叉反應(yīng)、試驗結(jié)果重現(xiàn)性差的風(fēng)險。此外，由于商品化試劑盒價格較昂貴，在一定程度上也限制其推廣使用。

4.3 高效液相色譜-熒光檢測法

高效液相色譜-熒光檢測法包括柱前衍生反應(yīng)法和柱后衍生反應(yīng)法，其原理是利用合適的溶劑提取出樣品中的待測物質(zhì)，加入衍生化試劑使待測物發(fā)生衍生化作用并在一定波長激發(fā)光的照射下產(chǎn)生熒光，通過分析熒光的吸收強(qiáng)度對待測物質(zhì)進(jìn)行定性定量。該方法可用于幾乎所有貝類毒素的檢測，是目前國內(nèi)外檢測PSP和DSP常用的方法之一[12]，PSP的檢測低限甚至達(dá)到了6.5～129 μg/kg[11]。

該方法檢測時間較小鼠生物測定法短，具有靈敏度高、檢測范圍廣，能夠完成大批量的檢測任務(wù)等優(yōu)點(diǎn)，但由于同系貝類毒素結(jié)構(gòu)相似、保留時間基本相同的特點(diǎn)，高效液相色譜-熒光檢測法對同系毒素的定性能力較差。另外，由于在檢測過程中用到的衍生化試劑也比較昂貴，部分熒光試劑不穩(wěn)定，需要現(xiàn)用現(xiàn)配等原因，使該方法的使用也受到一定的限制。

4.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是目前貝類毒素檢測中最有優(yōu)勢的一種分析方法，將液相色譜的分離技術(shù)與質(zhì)譜的分析技術(shù)有效結(jié)合起來對毒素的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。GB 5009.213—2016第四法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中PSP的檢出限為25.0～50.0 μg/kg[13]；GB 5009.212—2016第三法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中DSP檢出限為10.0 μg/kg[14]；GB 5009.198—2016第三法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中ASP檢出限為0.005 μg/kg[15]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法不需要實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)與干擾組分的完全色譜分離，即可提供待測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。其具有分析速度快、檢出限低、選擇性好、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，使得該方法在貝類毒素檢測中發(fā)展迅速。目前，該方法已收錄至國內(nèi)的國家標(biāo)準(zhǔn)方法中[13-15]，該方法具有定性和篩查未知物的能力，對新型毒素的發(fā)現(xiàn)和驗證有廣闊的發(fā)展前景。缺點(diǎn)是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀價格昂貴且需要專業(yè)的技術(shù)人員，檢測成本高。

5 結(jié)語

我國是貝類養(yǎng)殖大國，近年來由于赤潮出現(xiàn)頻繁，貝類毒素嚴(yán)重影響著貝類的食用安全和商品出口。目前針對貝類毒素的研究已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。建議加強(qiáng)對有毒藻類的類型、貝類養(yǎng)殖水域的質(zhì)量狀況、貝類毒素高發(fā)季節(jié)的影響因素和貝類毒素的檢測方法進(jìn)行綜合性的研究，以確保貝類產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

海南島是我國的第二大島，僅次于臺灣。豐富的海洋資源和得天獨(dú)厚的生態(tài)環(huán)境為熱帶貝類養(yǎng)殖提供了有利條件。貝類養(yǎng)殖作為海南海產(chǎn)養(yǎng)殖的重要產(chǎn)業(yè)，其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展關(guān)系著海南島藍(lán)色經(jīng)濟(jì)帶的建設(shè)。隨著近年來該海域有毒赤潮的不斷發(fā)生，該海域養(yǎng)殖貝類的食用安全存在較大風(fēng)險，但關(guān)于海洋毒素在海南島貝類中染毒狀況的研究卻非常少見[5]。這樣不利于海南省日常監(jiān)測工作的展開和貝類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為了保證水產(chǎn)品的食用安全性，減少食源性中毒的公共衛(wèi)生突發(fā)事件，提高消費(fèi)者的意識，急需了解貝類生物毒素污染狀況，不同產(chǎn)地、不同季節(jié)、不同貝類品種間貝類生物毒素分布規(guī)律，進(jìn)而為提高和改善水產(chǎn)品的質(zhì)量及安全性提供參考依據(jù)。