食品欺詐檢測中分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用進展

顧春華，劉煜，王建軍，孫霞，李中華

甘肅省食品檢驗研究院（蘭州 730030）

食品安全是全球矚目的問題，但近幾年食品欺詐卻越來越活躍于大眾視野。食品安全主要關(guān)注食品的食源性疾病和食品污染，大多時候并不是刻意摻假。在中國，經(jīng)過政府的大力治理，食品安全問題得到極大改善，根據(jù)國家市場監(jiān)督總局每年食品的檢測數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，真正的食品安全問題并不是特別多，而對消費者真正產(chǎn)生信任危機的卻是食品欺詐。食品欺詐被稱為有明確經(jīng)濟動機的摻假，是以經(jīng)濟利益為目的的食品造假行為，包括在食品、食品成分或食品包裝中蓄意使用非真實性物質(zhì)、替代品、添加物及去除真實成分，或進行篡改、虛報及做出虛假或誤導(dǎo)性的食品聲明等[1-2]，摻假者是在消費者不知情的情況下，為得到更大經(jīng)濟利益在食品中進行欺騙性的添加、減少或使用非傳統(tǒng)的物質(zhì)代替食品。雖然有些食品欺詐事件并沒有引起人身健康安全，但對消費者的信心打擊較重，對行業(yè)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展破壞較大。此外，還存在將養(yǎng)殖三文魚作為野生三文魚售賣，將希臘橄欖油標示為意大利橄欖油，將合成香料標為天然香料等標簽標示與產(chǎn)品真實性不符的問題。隨著食品供應(yīng)鏈復(fù)雜性越來越大，總體來講，野生或養(yǎng)殖、地理來源、生物物種方面的商業(yè)欺詐較多，比如對于占據(jù)水產(chǎn)市場份額較高的魚糜制品、半加工制品、聽裝制品的物種真實性較難識別問題[3]。因此，有效鑒別方法對生產(chǎn)者、消費者，甚至于動物保護都是很有必要的。基于此，本文在食品欺詐檢測中對分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)揮的作用、應(yīng)用狀況、技術(shù)局限等進行闡述。

自20世紀80年代以來，最初在食品領(lǐng)域發(fā)展起來的是酶分子和免疫鑒別技術(shù)，如等電聚焦電泳和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等，試驗的靶分子是蛋白質(zhì)，前者利用蛋白質(zhì)等電點不同的原理，后者利用蛋白質(zhì)的特異性抗原抗體屬性，但這些方法逐漸被淘汰，因為食物經(jīng)過冷卻、腌制、加熱等一系列加工后，其標志蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致這些方法呈現(xiàn)出低特異性和低適應(yīng)性。由此催生基于脫氧核糖核酸（DNA）分析的技術(shù)方法得到快速發(fā)展。DNA分析是在基因水平上對遺傳變異的直接反映，可以對不同發(fā)育階段的個體、不同的組織做檢測，既不受環(huán)境的影響，也不受基因是否表達的限制，而且基因組變異十分豐富，不僅能選擇表型性狀，也能選擇隱性性狀。Bostein于1980年提出分子標記技術(shù)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），為遺傳圖譜的構(gòu)建帶來革命性變革，隨著聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的產(chǎn)生，相關(guān)鑒別技術(shù)迅猛發(fā)展，對使用頻率較高、前沿的PCR技術(shù)、分子標記技術(shù)、芯片技術(shù)等進行介紹。

1 PCR檢測技術(shù)

PCR是一種在體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù)，是在DNA聚合酶的催化下，使用2段寡核苷酸作為引物，擴增位于2段已知序列之間的DNA區(qū)段。PCR技術(shù)簡單、快速、靈敏，可以同時鑒別多個物種，尤其是可以鑒別經(jīng)過高壓、加熱及聽裝的食物，這些食物中的蛋白質(zhì)雖遭到變性，但其DNA仍然可檢，因此成為實驗室的常規(guī)檢測方法。在進行PCR反應(yīng)前，目標基因的選擇，高效的DNA提取方法是需要考慮的因素。在歐洲瘋牛病危機爆發(fā)時，設(shè)計自線粒體16s核糖體核糖核酸（rRNA）的動物通用引物被廣泛用于動物源性的檢測[4]，最常見的線粒體靶向基因是細胞色素b（cytb）、12S rRNA、線粒體DNA D-環(huán)區(qū)基因、纈氨酰tRNA（tRNA）基因，線粒體脫氫酶亞基5基因（ND5），腺苷三磷酸酶（ATPase6/ATPase），以及廣泛使用的核能基因18S rRNA，短分散元件序列（SINE），長分散元件序列（LINE）等。另外，提取DNA時，某些食物可能含有抑制PCR的物質(zhì)，如糖類、全脂牛奶蛋白、膠原蛋白、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等，所以DNA的提取方式要能去除這些抑制物，必要時添加某些物質(zhì)，如牛血清白蛋白于體系[5]，有助于PCR反應(yīng)。

1.1 多重PCR

多重PCR是在一個反應(yīng)容器里同時擴增多個DNA靶點，與傳統(tǒng)的單一PCR系統(tǒng)相比，節(jié)省成本和時間，是一種很有發(fā)展前景的PCR技術(shù)[6]。它的成功依賴于多組引物在同樣的樣品量、同樣的循環(huán)條件下，向著各自的目標靶點退火的選擇性能力。它要求多對引物要設(shè)計合理，反應(yīng)條件最優(yōu)化，引物間不能形成二級結(jié)構(gòu)。Matsunaga等[7]首次通過用多重PCR方法檢測物種，在同一體系中對山羊、牛、羊、豬、馬的線粒體細胞色素b基因進行PCR，成功獲得鑒別。對加工的肉類，Di Pinto等[8]和Dhovvati等[9]用多重PCR均進行了方法驗證，結(jié)果較好。Yin等[10]在2009年用多重PCR鑒別牦牛肉和牛肉，DNA檢測限僅0.5 ng，靈敏度非常高。

1.2 實時熒光PCR（qPCR）

實時熒光PCR與通過凝膠電泳獲得定性結(jié)果的常規(guī)PCR相比屬于第二代PCR。它是在反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號的累積對PCR反應(yīng)過程實時監(jiān)控，并利用起始模板濃度的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈反比的原理繪制標準曲線，最終實現(xiàn)對初始模板進行定量。按熒光產(chǎn)生的原理不同分為染料法和探針法。染料法即利用SYBR綠色染料分子產(chǎn)生的熒光信號來進行樣品定量，試驗成本較低，信號強度好，使用方便，缺點是染料與DNA的結(jié)合只具有結(jié)構(gòu)特異性，不具有序列特異性，非特異性擴增會影響試驗結(jié)果，而且不能用于多重PCR。探針法是在反應(yīng)體系中除上下游引物外，再增加一條特異性探針，其擴增曲線反應(yīng)的就是特異性產(chǎn)物的擴增曲線，與染料法相比提高了試驗的特異性。市場上的探針主要有TaqMan、分子信標等，商業(yè)用途的檢測試劑盒大都采用這一技術(shù)。Soares等[11]建立一種基于SYBR綠色染料的實時定量方法去檢測肉制品中的豬肉，將已知含量的豬肉混合到禽肉中，獲得一個從0.1%到25%的標準曲線，并且通過熔融曲線分析有較高的特異性，經(jīng)過盲樣驗證，證明該方法定量檢測豬肉可行性較好。Zhang等[12]應(yīng)用實時定量PCR方法可以在鮮肉、加工肉類、牛奶、奶酪中將牛DNA鑒別并定量。設(shè)計一對牛的線粒體cytb基因特異引物，以及FAM標記的哺乳動物特異的cytb基因探針制作出標準曲線，定量檢測牛DNA最低至35 pg，并且與綿羊、山羊、豬的DNA無交叉反應(yīng)。Chen等[13]建立了一種快速鑒別石斑魚的實時PCR方法。根據(jù)線粒體細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ（COⅠ）基因序列設(shè)計引物和探針，對4個屬的10種石斑魚COⅠ基因序列進行擴增，均觀察到129 bp的結(jié)果，對其他30種魚類進行比較，未能擴增到，表明該方法特異性強，能對石斑魚進行有效鑒別。

1.3 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是第三代PCR技術(shù)[14]，沿襲qPCR熒光化學(xué)原理，但對靶標核酸的定量卻采用了完全不同的數(shù)學(xué)原理和技術(shù)方法。它不再依賴循環(huán)閾值（Ct值）或內(nèi)參標準，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目。它是將一個PCR反應(yīng)體系分配到大量微小的反應(yīng)單元中，在每個微反應(yīng)器中包含或不包含待測核酸靶分子，經(jīng)PCR擴增后，逐個對每個微反應(yīng)器進行檢測，有熒光信號的判讀為1，沒有熒光信號的判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度，實現(xiàn)了DNA分子的絕對定量[15-16]。Floren等[17]結(jié)合實時定量PCR建立針對核基因F2的兩步微滴數(shù)字PCR技術(shù)，用于對加工肉制品中牛、馬和豬的精確定量，其定量限和檢測限分別達到0.01%和0.001%。楊碩等[18]為定量鑒別核桃乳中摻雜大豆源，采用多重數(shù)字PCR技術(shù)，測算出單位質(zhì)量下核桃和大豆的目的基因拷貝數(shù)比值，建立基因拷貝數(shù)與質(zhì)量之間的關(guān)系，進而利用該比例關(guān)系換算出植物蛋白飲料中核桃和大豆的投料量，實現(xiàn)植物蛋白飲料中植物源性成分的定量檢測。但數(shù)字PCR的樣品通量低，且試驗成本較高，推廣和應(yīng)用還期待技術(shù)突破。

2 分子標記技術(shù)

分子標記技術(shù)是通過遺傳圖譜，指紋識別來識別個體，它不僅能區(qū)分摻假的物種，也能區(qū)分亞種。在食品檢測中，得到廣泛運用的分子標記技術(shù)是限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴增酶切片段多態(tài)性（AFLP）、簡單重復(fù)序列（SSR）等。

2.1 RFLP

R F L P 是用限制性內(nèi)切酶處理不同的生物體DNA，產(chǎn)生不同長度的分子片段，這種限制性片段長度的差異就是RFLP。之所以有限制性片段長度的多態(tài)性，是因為生物體在長期進化過程中，種屬間甚至品種間同源DNA序列上限制性內(nèi)切酶的識別位點不同，或者由于突變、重組等原因引起限制性內(nèi)切酶位點上核苷酸的插入和缺失造成的。在檢測親緣關(guān)系較近的食品摻假方面有較高的準確性。Wang等[19]提出一種PCR-RFLP方法用于阿膠原料的鑒別，從馬、牛、驢的干燥皮膚中提取DNA，在細胞色素b保守區(qū)分離到359 bp的片段，將這個片段用2個限制性內(nèi)切酶酶切，獲得DNA指紋，據(jù)稱準確率可達100%。劉金華等[20]通過對綠豆RFLP分子標記圖中特異片段序列擴增，成功獲得470 bp大小的片段，并與大豆、豇豆等其他豆類做驗證，證明該引物具有較強的特異性。但RFLP很容易受到個體突變的影響，如果突變發(fā)生在限制位點，就會產(chǎn)生錯誤的限制圖譜。另外，在深加工食品的檢測中，因為DNA片段很短，很難找到限制位點，限制性內(nèi)切酶不完全消化時，就會出現(xiàn)假陰性。

2.2 RAPD

RAPD是利用寡核苷酸隨機引物，對基因組進行PCR擴增，與RFLP一樣，均以檢出DNA多態(tài)性為目的，但其檢出的不是限制性內(nèi)切酶片段的多態(tài)性，而是隨機擴增DNA片段的多態(tài)性。RAPD不需要雜交、同位素標記等復(fù)雜程序，只需要合成一套隨機引物，便可以用于任何物種，是一種快速、簡便的遺傳標記方法。徐穎等[21]用50個隨機引物對泰國香米和非茉莉香米進行擴增，其中22個引物擴增出多態(tài)性，并通過S1-1110和S15-450這2個條帶的隱性特征來區(qū)分泰國香米和非茉莉香米。Saez等[22]建立一種RAPD方法，產(chǎn)生的特異性指紋圖譜可以區(qū)分豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和火雞，每個物種有75%相似性和25%物種多態(tài)性。RAPD雖然簡便快捷，但它的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性都低于RFLP，引物的長度和數(shù)量也不統(tǒng)一，導(dǎo)致不同實驗室間數(shù)據(jù)沒有可比性。

2.3 AFLP

AFLP是由RAPD和RFLP合成發(fā)展而來，它是用2個限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切消化，將酶切片段用人工接頭連接，用特別設(shè)計的引物對片段進行選擇性擴增，從而揭示DNA的多態(tài)性。AFLP具有RFLP的可靠性和可重復(fù)性，也有RAPD高效、方便的特點，還具有多態(tài)分辨率高，僅需少量DNA模板的優(yōu)勢，因此常用于分析親緣關(guān)系較近的不同品種的食物造假。如鄢緋寰等[23]用AFLP分析8種家鴨和2種野鴨的基因組DNA，通過計算遺傳距離和相似性系數(shù)將不同品種得以區(qū)分。高軍等[24]實現(xiàn)對21個中國地方豬、19個歐美商業(yè)豬、5個亞歐美野豬等47個豬群的AFLP檢測，用22種引物組合產(chǎn)生了312個AFLP多態(tài)標記，并計算出47個類群間的遺傳相似系數(shù)。王曉英等[25]用AFLP技術(shù)對4個元帥系蘋果品種進行遺傳分析，總共12對引物擴增出了多態(tài)性條帶595條，多態(tài)率達72%，建立了蘋果的AFLP標記技術(shù)體系。AFLP技術(shù)的缺點是成本高，對DNA的純度和酶的質(zhì)量要求較高，對實驗者的操作技能也要求較高。

2.4 SSR

SSR也稱為微衛(wèi)星DNA，是一類由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列。在每個微衛(wèi)星兩端是相對保守的特異單拷貝序列，因此可根據(jù)兩端的序列，設(shè)計一對特異引物。微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目是高度變異的，其序列也可能完全不同，因此微衛(wèi)星顯示高度的長度多態(tài)性。楊航宇等[26]利用SSR技術(shù)，用6對引物對43份葡萄品種進行分析，擴增出64個多態(tài)性位點，可以區(qū)分釀酒品種、鮮食品種，并能區(qū)分歐亞種和歐美種。但是SSR必須針對每個染色體座位的微衛(wèi)星，找出兩端的單拷貝序列來設(shè)計引物，這給微衛(wèi)星標記的應(yīng)用帶來困難。

3 基因芯片

基因芯片是利用雜交測序的原理，把寡核苷酸探針或DNA，cDNA采用類似大規(guī)模集成電路的手段有規(guī)律地排列固定在硅片上，與樣品進行反應(yīng)后，通過掃描獲得有關(guān)生物信息。從樣品制備、雜交反應(yīng)到信號檢測，整個過程集成化，獲得微型全分析。它可以檢測DNA序列中單個堿基的改變，可進行基因多態(tài)性分析，這種多態(tài)性比RFLP、微衛(wèi)星標記等覆蓋密度更大，數(shù)目也更多，即單核苷酸多態(tài)性標記（SNPs）。通常，芯片采用等長位移設(shè)計法，按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互補核苷酸序列形成探針組合，某一堿基分別用其他三種堿基替換，形成3種不同的單堿基變化的核苷酸探針，可對這段核苷酸序列所有可能的SNP位點進行掃描，實現(xiàn)點突變的檢測。石豐運[27]建立一種PCR結(jié)合基因芯片鑒別16種動物源性的方法，該方法快速、準確、特異性好，靈敏度可達10 pg，用于對牛、山羊、綿羊、水牛、鹿、驢、豬、狗、兔、雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞、鴕鳥、魚等的檢測。但是基因芯片合成設(shè)備昂貴，成本較高，樣品制備復(fù)雜，而且雜交在固相上進行，空間因素也對雜交造成不利影響。

4 討論和展望

食品欺詐是食品風(fēng)險的一種，是世界范圍內(nèi)各國監(jiān)管的重點。每年由于食品欺詐造成的損失十分巨大。產(chǎn)地、物種、品種等的虛假聲稱最為普遍。就肉類產(chǎn)品的標簽與實際不符的情況，美國19.4%[28]、耳其22%[29]、瑞士15%[30]、英國8%[30]。中國在2013年破獲多起將鼠肉、狐貍?cè)?、水貂肉加工后當作羊肉售賣的犯罪行為。在土耳其，某香腸標簽上標示含有5%牛肉，實際并沒有發(fā)現(xiàn)牛肉DNA，標示100%牛肉的牛肉丸，卻發(fā)現(xiàn)含有雞肉和火雞[31]。鑒別方法的發(fā)展也是經(jīng)過最初的基于形態(tài)的味、色、形[32]，到后來的顯微鏡觀察[33-35]，以及顯微鏡不能確定物種起源而被生物技術(shù)所代替，這是技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。但是隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，食品形態(tài)越來越豐富，不法分子的造假手段也不盡相同，所述的分子生物學(xué)技術(shù)也各有優(yōu)缺點，甚至還普遍存在不能有效識別異構(gòu)體的問題，因此有必要聯(lián)合其他技術(shù)方法包括理化方法，為食品欺詐的檢測提供更多的思路。

在選擇DNA靶標時，線粒體基因組因為比核基因組具有更多優(yōu)點，所以常常被選為分子檢測的標的。尤其是線粒體DNA在細胞中以多拷貝形式存在，即便是少量DNA，被檢測到的可能性也很大。而且，有些加工食物會受到熱處理，如烹調(diào)、巴氏殺菌、高溫滅菌等，或高壓、pH調(diào)節(jié)、輻射、干燥等，對這些高度退化的食物，更適用于線粒體基因，因為可以達到高靈敏度的要求。但是，用線粒體基因組作為物種特異性量化的標的則存在問題。因為不同物種的不同細胞，同一物種的不同個體，同一個體的不同組織，其線粒體基因的拷貝數(shù)都是不同的。為解決這個問題，Walker等[36]用基因組DNA的重復(fù)序列，短分散元件SINE量化了來自食物中的牛、豬、雞。

另外，對于分子生物技術(shù)的高靈敏性帶來的其他問題也應(yīng)引起重視。如在一個既加工由純水牛乳制的奶酪又加工普通奶酪的工廠去檢測由純水牛乳制的奶酪是否摻了普通牛乳成分，會產(chǎn)生交叉污染[37]。在這種情況下很難區(qū)分是污染還是故意摻假。因此，加工不同物種的食品用不同的生產(chǎn)線是必要的，尤其是原產(chǎn)地保護產(chǎn)品。

5 結(jié)語

食品中物種鑒定技術(shù)是打擊食品摻假、食品欺詐、維護市場秩序的有效保障。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為食品真實性檢測開辟了新的途徑，使物種鑒定的定量分析和溯源成為可能，該領(lǐng)域也必將成為未來研究熱點受到持續(xù)關(guān)注。