土家藥豨簽草的活性成分提取及其抑菌效果*

劉力瑋,楊夢露,覃希榕,劉銘昱,唐振威,侯 娟,2

（1吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2吉首大學(xué)湖南省土家藥研究中心，湖南 吉首 416000）

隨著抗生素在臨床醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用,病原體對(duì)傳統(tǒng)抗生素類型藥物的抗藥性越來越明顯,導(dǎo)致抗生素的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用愈發(fā)局限性[1],并且傳統(tǒng)抗生素藥物對(duì)身體會(huì)產(chǎn)生副作用,現(xiàn)在人們開始逐漸關(guān)注中藥的抗菌效果[2]。湘西動(dòng)氣候適宜,植物資源豐富,有著燦爛的醫(yī)藥文化,其中有一種名為豨薟草的土家族藥材,具有祛風(fēng)濕,通經(jīng)絡(luò),清熱解毒之功效[3],可以用來治療黃疸,蟲獸咬傷等疾病[4]。臨床可用于祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、抗炎、降血壓[5-6]。豨簽草中所含有的抑菌物質(zhì)是一種豨薟堿類生物堿的成分。為了更加深入的研究豨簽草生物堿成分的抗菌效果,從豨簽草中提取了豨薟堿,采用常見的病原菌做實(shí)驗(yàn)進(jìn)進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)并對(duì)敏感菌的最小抑菌濃度進(jìn)行檢測[7-8]。本文擬以植物該的提取物為材料,以常見的病原菌為實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。研究粘草子中生物堿成分的抑菌效果,為進(jìn)一步深入研究與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供實(shí)材料豨簽草材料于2018年6月15日采于湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市矮寨鄉(xiāng)德夯村(經(jīng)度:109.57,緯度:28.34采摘）,經(jīng)鑒定為菊科植物豨薟的全草,將帶花果的豨簽草全草放入恒溫箱干,控溫105℃干燥24 h,取出冷至室溫用FZ-102植物粉碎機(jī)將干燥后的豨簽草粉碎備用。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

肺炎鏈球菌,金黃色葡萄球菌,大腸桿菌,銅綠假單胞菌,枯草桿菌共5種標(biāo)準(zhǔn)菌,肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀 器

電熱恒溫培養(yǎng)箱；光學(xué)顯微鏡；型恒溫水浴鍋；植物粉碎機(jī)；高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 正交設(shè)計(jì)

將豨簽草放入恒溫箱干,控溫105℃干燥24 h,取出冷至室溫用植物粉碎機(jī)將干燥后的豨簽草粉碎,然后準(zhǔn)確稱取粉碎后的黏草子。分別稱取10 g豨簽草以10∶1液料比獲得浸提液。

1.2.1.1 醇提正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,總和單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取影響乙醇浸提豨簽草浸提液抑菌效果的影響因素:乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)(Ⅰ）、浸提溫度(Ⅱ）、浸提時(shí)間(Ⅲ）,實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.2.1.2 水提實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

水提實(shí)驗(yàn)分為兩組,第一組均用沸水分別浸提60、120、240、360 min；第二組:在第一組基礎(chǔ)上,分別用60、70、80、90℃蒸餾水浸提。為保持溫度,實(shí)驗(yàn)在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 方法及最小抑菌濃度的測定

根據(jù)上述1.2.1.1與1.2.1.2的方法獲取豨簽草的提取液,采用無菌鹽水配置待試菌懸液。分別吸取0.2 mL的待試菌懸液放入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面上,然后進(jìn)行均勻的涂抹,然后放入(37±0.5）℃的培養(yǎng)箱中干燥20 min,待瓊脂凝結(jié)后,放入到恒溫箱中,在(37±0.5）℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)1～2 d,觀察細(xì)菌的生長情況。

圖1 濾紙片法Fig.1 Filter paper method

采用濾紙片法進(jìn)行對(duì)抑菌效果進(jìn)行測定,如圖1所示,采用直徑為6 mm的滅菌濾紙片,放在豨簽草提取液中浸泡2 d,然后使用無菌的鑷子取出濾紙片然后放在含菌平板上,每皿放入7片,其中1張空白濾紙作為對(duì)照,其余6張均勻排列,每種菌做兩組平行實(shí)驗(yàn)。

最小抑菌濃度(MIC）的測定:將無菌水在1.2.1.1與1.2.1.2獲取提取液稀釋成若干梯度的溶液,用滅菌移液搶吸取1 mL稀釋的提取液放入要培養(yǎng)皿中,放入培養(yǎng)基,然后在分布吸取0.1 mL的各種各種供試菌菌懸液放入到培養(yǎng)皿表面,采用涂布棒將提取液均勻涂布,然后蓋好培養(yǎng)皿,置于(37±1）℃溫度下的恒溫箱中培養(yǎng)18 h。采用無菌生長的濃度為最低抑菌濃度。以無菌生理鹽水做空白對(duì)照[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 醇提正交實(shí)驗(yàn)

乙醇提取豨簽草浸提液抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可知,不同水平組合下,抑菌環(huán)的大小存在明顯差異。對(duì)于銅綠假單胞菌和大腸桿菌而言,Ⅰ1Ⅱ1Ⅲ1組合的抑菌環(huán)分別達(dá)到最大；而Ⅰ3Ⅱ3Ⅲ2組合對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌和枯草桿菌的抑菌環(huán)分別為最大。

表2 醇提抑菌正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of alcohol extraction and bacteriostasis

2.2 水提實(shí)驗(yàn)結(jié)果

豨簽草在60、120、240、360 min這幾個(gè)時(shí)間段內(nèi)用蒸餾水浸提所得浸提液的抑菌環(huán)直徑變化趨勢見圖2。結(jié)果顯示,在60、120、240 min兩個(gè)豨簽草提取液的浸泡時(shí)間會(huì)產(chǎn)生抑菌效果,2～4 h的時(shí)間段抑菌效果逐漸減弱,240～360 min的抑菌效果出現(xiàn)明顯下降的趨勢,浸泡超過360 min已經(jīng)基本上起不到抑菌的作用。因此,當(dāng)浸泡時(shí)間低于120 min,抑菌效果隨著浸泡時(shí)間的增加而增強(qiáng)；當(dāng)浸泡時(shí)間超過120 min后,抑菌效果開始逐漸下降,最后消失,因而水提實(shí)驗(yàn)采用n的浸泡時(shí)間為120 min。

豨簽草在60、70、80、90℃ 4個(gè)溫度梯度下用蒸餾水浸提120 min所得浸提液的抑菌環(huán)直徑變化趨勢見圖3。結(jié)果顯示,60、70℃下浸提液無抑菌現(xiàn)象。80、90℃下對(duì)5種菌均有抑菌現(xiàn)象,且80℃下抑菌環(huán)直徑較大,90℃下抑菌效果顯著下降?？梢?80℃的溫度能夠更好地提取出豨簽草中的抑菌物質(zhì),而90℃的溫度過高,可能導(dǎo)致效應(yīng)物揮發(fā),故確定水提實(shí)驗(yàn)采用80℃的溫度浸泡。

圖2 不同水提時(shí)間抑菌環(huán)直徑變化趨勢圖Fig.2 Variation Trend of diameter of bacteriostatic ring in different water extraction time

圖3 不同水提溫度抑菌環(huán)直徑變化趨勢圖Fig.3 Variation Trend of diameter of bacteriostatic ring at different water extraction temperature

2.3 豨簽草浸潤提取液的最小抑菌濃度

表3 豨簽草浸提液對(duì)各供試菌種的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of the extract of Herba Siegesbeckiae

通過實(shí)驗(yàn),豨簽草水提液與醇提液均對(duì)各供試菌有良好的抑制效果。我們進(jìn)而采取最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)法來進(jìn)一步探究抑制作用和對(duì)各菌種最小抑菌的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,此結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,豨簽草提取液對(duì)5種供試菌均具有抑制效果。由表3可知最小抑菌濃度下,豨簽草水提取液對(duì)枯草桿菌的MIC值影響最大,豨簽草的淳提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC影響較為明顯,豨簽草無論是水提取液和醇提液均對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度均為最低,說明豨簽草提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的影響較為明顯。在同種豨簽草提取液濃度下,豨簽草的醇提取液比水提取液抑菌效果更明顯,可能是由于乙醇本身具有抑菌的作用,或者乙醇對(duì)豨簽草的抗菌物質(zhì)提取更明顯。

3 結(jié) 論

通過研究發(fā)現(xiàn),不管是粘草子的乙醇提取物還是水提取物對(duì)常見有害菌有抑制作用。本項(xiàng)中,粘草子醇提取物在醇濃度高,浸潤溫度和浸潤時(shí)間較長的情況下對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和枯草桿菌在抑菌方面比較顯著。

下一步值得探究的是將豨簽草的提取物中各種成分進(jìn)行分離并研究各種成分對(duì)抑菌效果產(chǎn)生的影響。雖然關(guān)于豨簽草的研究很多,但是對(duì)于抑菌效果以及比較方面的研究卻較少。本課題在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上,對(duì)土家族特色中藥豨簽草資源開展抑菌活性成分的提取,可帶動(dòng)以豨簽草為原料的抑菌藥物和保健品等市場的發(fā)展,拓廣養(yǎng)生醫(yī)藥行業(yè)并帶動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展,對(duì)中藥材的開發(fā)有強(qiáng)大的引領(lǐng)作用。