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    黃連中抗腫瘤生物堿的計(jì)算機(jī)虛擬篩選研究

    2020-04-18 04:02:56劉新橋王靜袁橋玉宋煒胡貝李竣
    關(guān)鍵詞:阿魏合酶防己

    劉新橋,王靜,袁橋玉,宋煒,胡貝,李竣

    (1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,武漢 430074;2 武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院,武漢 430074)

    黃連為毛莫科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖,主要分布于湖北、重慶、四川、云南、貴州、湖南、陜西南部. 黃連根莖味苦,性寒,歸心、胃、肝、大腸經(jīng),具清熱瀉火、燥濕解毒之功效[1]. 臨床上多用于治療痢疾、急性胃腸炎、慢性腹瀉、呼吸道感染以及各種炎癥. 近年來(lái),大量藥理研究表明,其在抗癌、抗心律失常、降血糖等方面亦有明顯作用[2,3],其作用主要與其根莖所含的生物堿(約占根莖的4%~ 8%)有關(guān)[1]. 黃連中所含化學(xué)成分黃連總堿和小檗堿對(duì)多種體外培養(yǎng)的食道癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[4].

    與常規(guī)篩選和高通量篩選需要的樣品制備和高成本相比,分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)的過(guò)程更加簡(jiǎn)單和高效,對(duì)確定化合物的作用靶點(diǎn)和闡述作用機(jī)制具有提示作用.本研究針對(duì)中藥藥效弱、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),基于計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù),從黃連生物堿中篩選抗腫瘤活性的天然配體和可能的作用靶點(diǎn),為黃連抗腫瘤作用機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)和參考.

    1 資料與方法

    1.1 資料來(lái)源

    蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB,網(wǎng)址:http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do);小分子化合物結(jié)構(gòu)下載(PubChem,網(wǎng)址:https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,網(wǎng)址:http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php);Sybyl 1.0軟件(美國(guó)Tripos公司);Discovery Studio 2017 R2 Client(DS,網(wǎng)址:https://www.3dsbiovia.com/).

    1.2 方法

    1.2.1 小分子配體的準(zhǔn)備

    以“黃連”作為關(guān)鍵詞,從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索生物堿類(lèi)化學(xué)成分,從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載相應(yīng)化合物結(jié)構(gòu),用Chem3D轉(zhuǎn)為mol2格式,建立配體小分子化合物庫(kù). 所有配體小分子均采用分子力學(xué)程序Minimize進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,賦予Tripos力場(chǎng)及加載Gasteiger-Huckel電荷,優(yōu)化后得到的穩(wěn)定構(gòu)象保存為mol2格式.

    1.2.2 受體結(jié)構(gòu)信息來(lái)源及處理

    本文所用蛋白見(jiàn)表1,從PDB中搜索目標(biāo)靶蛋白并下載其三維結(jié)構(gòu),對(duì)靶蛋白用Application 中的Docking模塊進(jìn)行修飾、加氫及加載AMBER FF99電荷,并根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體確定對(duì)接的活性位點(diǎn),將處理后的蛋白保存.

    1.2.3 分子對(duì)接

    以生物堿類(lèi)化合物為配體,以17個(gè)抗腫瘤作用的靶點(diǎn)為受體,利用sybyl1.0軟件Surflex-dock模塊進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接的結(jié)果以打分函數(shù)Total Score 給出,以mol2格式保存. 利用SYBYL 分子對(duì)接模塊的Total Score 打分函數(shù)對(duì)配體分子進(jìn)行篩選,Total Score 綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和熔劑化等因素,該值越大,對(duì)接復(fù)合物越穩(wěn)定,說(shuō)明小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)的匹配結(jié)合作用越好.

    1.2.4 數(shù)據(jù)分析與圖像處理

    采用Discovery Studio軟件中receptor-Ligand Interactions模塊對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析.

    表1 對(duì)接研究使用的受體蛋白 Tab.1 The receptor protein of molecular docking

    2 結(jié)果

    2.1 生物堿成分搜索結(jié)果

    在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中,共搜索到黃連中的21個(gè)生物堿成分,配體分子信息見(jiàn)表2.

    表2 配體分子的名稱及信息Tab.2 Name and information of ligands molecule

    2.2 分子對(duì)接結(jié)果

    下載21個(gè)黃連生物堿小分子配體與靶蛋白進(jìn)行對(duì)接, 篩選出具有較好結(jié)合活性的化合物9個(gè),分別為:小檗堿、非洲防己堿、表小檗堿、格陵蘭黃連堿、黃柏堿、氧化小蘗堿、巴馬亭、甲基黃連堿、N-反式-阿魏酰酪胺. 其中非洲防己堿、巴馬亭、N-反式-阿魏酰酪胺與多個(gè)靶標(biāo)蛋白有結(jié)合活性. 小檗堿與靶蛋白組蛋白去乙?;?HDAC)結(jié)合最好,非洲防己堿、格陵蘭黃連堿、巴馬亭、N-反式-阿魏酰酪胺與環(huán)氧合酶2(COX-2)結(jié)合最好,表小檗堿、氧化小蘗堿、甲基黃連堿與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)結(jié)合最好,黃柏堿與Polo樣激酶2(PLK-2)結(jié)合活性最好. 該結(jié)果表現(xiàn)出的多成分對(duì)靶標(biāo)點(diǎn)的共同作用的特點(diǎn),為闡述黃連抗腫瘤作用機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ),各成分也可作為靶蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物加以研究. 黃連生物堿成分與靶蛋白具體對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表3,結(jié)合較好的6個(gè)代表性蛋白復(fù)合體的相互作用力分析見(jiàn)圖1 ~ 6.

    2.3 對(duì)接結(jié)果分析

    2.3.1 小檗堿與組蛋白去乙?;赶嗷プ饔?/p>

    小檗堿與17個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接后,與組蛋白去乙?;附Y(jié)合最好,Total score為7.0813;其對(duì)接效果見(jiàn)圖1. 從圖1c可以看出,疏水相互作用力在此對(duì)接中起重要作用;同時(shí)小檗堿與HIS21形成了氫鍵,與HIS170、LEU265形成C—H鍵.

    圖1 小檗堿與組蛋白去乙酰化酶分子對(duì)接效果圖Fig.1 Docking renderings of berberine with HDAC

    2.3.2 非洲防己堿與環(huán)氧合酶-2相互作用

    非洲防己堿與17個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接后,與環(huán)氧合酶-2結(jié)合最好,Total score為7.5269(圖2). 從圖2c可以看出,疏水相互作用力在此對(duì)接中起重要作用;同時(shí)非洲防己堿與GLN192、PHE518、SER530形成了氫鍵,與SER353和GLN192形成C—H鍵.

    圖2 非洲防己堿與環(huán)氧合酶-2分子對(duì)接效果圖Fig.2 Docking renderings of columbamine with COX-2

    2.3.3 表小檗堿與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1相互作用

    表小檗堿與17個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接后,與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1結(jié)合最好,Total score為7.1675;其對(duì)接效果見(jiàn)圖3. 從圖3c可以看出,疏水相互作用力在此對(duì)接中起重要作用;同時(shí)表小檗堿與ASP223、LYS111形成了氫鍵,與LYS163、GLU209、ASN210和ASP223形成C—H鍵.

    2.3.4 黃柏堿與Polo樣激酶-2相互作用

    黃柏堿與17個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接后,與Polo樣激酶-2結(jié)合最好,Total score為7.2188;其對(duì)接效果見(jiàn)圖4. 從圖4c可以看出,疏水相互作用力在此對(duì)接中起重要作用;同時(shí)黃柏堿與GLU131、SER134形成了氫鍵.

    2.3.5 巴馬亭與環(huán)氧合酶-2相互作用

    巴馬亭與17個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接后,與環(huán)氧合酶-2結(jié)合最好,Total score為7.9135;其對(duì)接效果見(jiàn)圖5. 從圖5c可以看出,疏水相互作用力在此對(duì)接中起重要作用;同時(shí)巴馬亭與SER530、ARG513形成了氫鍵,與LEU352、GLN192形成C—H鍵.

    2.3.6N-反式-阿魏酰酪胺與環(huán)氧合酶-2相互作用

    N-反式-阿魏酰酪胺與17個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接后,與環(huán)氧合酶-2結(jié)合最好,Total score為8.7050;其對(duì)接效果見(jiàn)圖7. 從圖6c可以看出,疏水相互作用力在此對(duì)接中起重要作用;同時(shí)N-反式-阿魏酰酪胺與GLN192、PHE518、SER530形成氫鍵.

    圖3 表小檗堿與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1分子對(duì)接效果圖Fig.3 Docking renderings of epiberberinewith PDK1

    圖4 黃柏堿與Polo樣激酶-2分子對(duì)接效果圖Fig4 Docking renderings of phellodendrinewith PLK2

    圖5 巴馬亭與環(huán)氧合酶-2分子對(duì)接效果圖Fig. 5 Docking renderings of palmatinewith COX-2

    圖6 N-反式-阿魏酰酪胺與環(huán)氧合酶-2分子對(duì)接效果圖Fig.6 Docking renderings of moupinamide with COX-2

    3 討論

    Sybyl軟件是研究者從傳統(tǒng)中草藥中尋找到相關(guān)靶點(diǎn)的潛在活性化合物并確定其藥理活性的重要手段[5]. 選取與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的蛋白EGFR 、VEGFR2[6],與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白COX-2[7]、PLK-1、PLK-2[8]和腫瘤細(xì)胞端粒酶等17個(gè)相關(guān)靶標(biāo)為篩選靶點(diǎn),運(yùn)用Sybyl軟件的Surflex-dock模塊對(duì)中藥黃連中21個(gè)生物堿成分進(jìn)行篩選,篩選出3個(gè)具有多靶點(diǎn)抗腫瘤作用的活性分子活性分子非洲防己堿、巴馬亭、N-反式-阿魏酰酪胺. 從計(jì)算機(jī)虛擬篩選的角度驗(yàn)證了中藥黃連在抗腫瘤作用中,表現(xiàn)出多種成分對(duì)靶標(biāo)點(diǎn)的共同作用的特點(diǎn). 然后運(yùn)用Discovery Studio Visualizer 軟件對(duì)結(jié)合最好的蛋白復(fù)合物相互作用力進(jìn)行分析,證實(shí)氫鍵和疏水作用力在各自的對(duì)接中起著重要的作用. 已有研究顯示,非洲防己堿對(duì)人肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞增殖有一定的抑制作用;氨基酸Ser530在環(huán)氧合酶-2催化過(guò)程起到關(guān)鍵的作用[9]. 從2c圖可以看到,非洲防己堿與環(huán)氧合酶-2核心氨基酸均有相互作用. 黃連活性成分與靶蛋白的核心氨基酸存在相互的作用力, 而二維圖可以幫助了解黃連活性成分與受體對(duì)接的作用力和位置結(jié)合等情況,有助于闡述抗腫瘤作用機(jī)制.

    本文建立的方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的不足,提高了先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)效率,為抗腫瘤中藥多靶點(diǎn)作用的研究奠定了基礎(chǔ).

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