甲維鹽對海洋橈足類火腿偽鏢水蚤的急慢性毒性效應(yīng)

衣曉燕，周 強(qiáng)，呂海金，趙美法，韋如意，劉光興

（1.青島職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工學(xué)院，山東 青島 266555；2.青島海洋科技館，山東 青島 266003；3.中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100； 4.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100）

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（簡稱甲維鹽，Emamectin benzoate，EMB）是一種新型的高效半合成抗生素殺蟲劑，既有胃毒作用又兼觸殺作用，通過打開肌肉和神經(jīng)組織的氯離子通道，增加膜對氯離子的通透性起作用，從而抑制神經(jīng)沖動的傳輸，導(dǎo)致昆蟲癱瘓最終死亡[1-2]。在國內(nèi)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治[3]，在國外被廣泛用于鮭魚的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，以殺滅寄生在鮭魚體內(nèi)或體表的寄生性魚虱Lepeophtheirus salmonis和Caligus rogercresseyi[4]。EMB 會隨著地表徑流或者直接排入的方式進(jìn)入海洋生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致海洋水體污染，對海洋生物造成一定影響，尤其對海洋甲殼類具有較強(qiáng)毒性[5-6]。

海洋橈足類作為能流和物流的重要“橋梁”，在維持海洋生態(tài)平衡和穩(wěn)定中起著重要作用[7-8]。浮游橈足類和寄生性橈足類具有類似的生長發(fā)育過程，EMB 可以有效殺滅各階段的寄生性橈足類魚虱，也對浮游橈足類產(chǎn)生了一定的毒性效應(yīng)[5]，而且海洋浮游橈足類對環(huán)境變化敏感，是反映海洋生態(tài)系統(tǒng)受到影響的一種理想的毒性試驗材料[9]。

目前，關(guān)于EMB 對浮游動物及海洋生態(tài)系統(tǒng)毒性的研究國內(nèi)鮮見，更多的研究聚焦在EMB 對陸生或淡水水生生物的毒性效應(yīng)研究上[10-11]。筆者選取我國近海浮游橈足類常見種火腿偽鏢水蚤（Pseudodiaptomus poplesia）作為研究對象，通過急慢性毒性試驗在個體水平上研究不同濃度EMB 對其呼吸、常見氧化酶活性、生殖、生長發(fā)育等的影響，為進(jìn)一步推測和評估EMB 對海洋浮游橈足類產(chǎn)生的毒性效應(yīng)和整個海洋生態(tài)系統(tǒng)可能產(chǎn)生的危害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 火腿偽鏢水蚤的采集與培養(yǎng)

供試火腿偽鏢水蚤用淺水Ⅰ型浮游生物網(wǎng)采自青島近海，采集后即帶回實驗室暫養(yǎng)。在體視顯微鏡（S8APO，LEICA）下挑選健康活潑的成體，在光照培養(yǎng)箱（GXZ-280B-LED，寧波江南儀器廠）內(nèi)用人工海水進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度22±1℃，鹽度（20±1）‰，光照強(qiáng)度3 000 lx，光暗周期14L ∶10D，餌料單胞藻金藻（IsochrysisgalbanaParke8701）的終濃度在104～105個/mL 范圍內(nèi)。

1.2 EMB 溶液的配制

稱 取 純 度 為99.4% EMB（PESTANAL?Sigma-Aldrich，USA）10 mg，溶于5 mL 二甲基亞砜（DMSO），配制成2 mg/mL 的儲備液，4℃避光保存。用0.45 μm滅菌膜過濾鹽度為（20±1）‰的人工海水，稀釋儲備液以配制濃度范圍0.02～800 ng/mL 的EMB 溶液（表1）。最高濃度梯度中試劑DMSO 的濃度為400 μL/L。每48 h 更換50%的暴露液。

1.3 急性毒性試驗

用一次性巴斯德吸管轉(zhuǎn)移火腿偽鏢水蚤成體，暴露在不同濃度EMB 溶液中96 h （表1），以獲得96h-LC50。試驗在裝有80 mL 膜濾海水的100 mL 玻璃燒杯中進(jìn)行，試驗條件同培養(yǎng)條件。每天早上9：00 在解剖鏡下觀測并記錄個體存活情況，直至96 h。解剖針輕觸或水流緩慢沖擊，無反應(yīng)者視為死亡。同樣，為獲得24h-EC50，將成體暴露在不同濃度EMB 溶液中 （表1），24 h 后觀測并記錄未死亡但活動能力明顯減弱（長時間趴在燒杯底部靜止不動，解剖針觸碰或水流緩慢沖擊才有反應(yīng)）的個體數(shù)。

根據(jù)24h-EC50設(shè)置濃度梯度（表1），將成體暴露在不同濃度EMB 溶液中，24 h 后觀測火腿偽鏢水蚤的呼吸率以及過氧化氫酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase, GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）、超氧化物歧化酶（superoxide disnmtase, SOD）等生理指標(biāo)的變化。呼吸率試驗在裝有200 mL 膜濾海水的200 mL玻璃磨口瓶中避光進(jìn)行；氧化酶活性試驗在裝有800 mL 膜濾海水的1 L 玻璃燒杯中進(jìn)行。

1.4 亞慢性毒性試驗

火腿偽鏢水蚤N1 期無節(jié)幼蟲孵出24 h 內(nèi)，挑選健康活潑的幼體將其分別暴露在不同濃度EMB 溶液中（表1）。試驗個體在EMB 中持續(xù)暴露30 d，每只個體單獨(dú)培養(yǎng)在裝有7 mL 膜濾海水的10 mL 細(xì)胞培養(yǎng)板中，每48 h 更換50%體積的EMB 溶液并投餌，試驗條件同急性毒性試驗。當(dāng)雌性個體發(fā)育至性成熟時，挑選健康活潑的雄性個體2～3 只，混合培養(yǎng)。每天15: 00 在解剖鏡下觀察并記錄個體的存活、所處發(fā)育階段、抱卵及孵化情況。

表1 火腿偽鏢水蚤毒性試驗設(shè)置

各濃度組90%的無節(jié)幼蟲發(fā)育至橈足幼體（C1）所需的時間即為無節(jié)幼蟲發(fā)育成橈足幼體所需的時間；90%的橈足幼體成功發(fā)育至成體（C6）的時間即為橈足幼體發(fā)育成成體所需的時間；記錄雌性個體首次抱卵的時間，計算孵化率[12]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用改良的寇氏法計算求得96 h 的半數(shù)致死濃度（96h-LC50）[12]，添加趨勢線求得24h-EC50。用溶氧 儀（Yellow Springs Instruments，YSI5000）測得溶解氧含量以計算耗氧率[13]。根據(jù)南京建成生物工程研究所（http://www.njjcbio.com/）提供的試劑盒，用紫外可見分光光度計測定CAT、GST、GSH-Px 和SOD 的酶活。

用SPSS 19.0 軟件中的One-way ANOVA 進(jìn)行單因素方差顯著性分析，用Origin 8.5 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMB 對火腿偽鏢水蚤的急性毒性

由表2 可知，不同濃度EMB 溶液暴露下，火腿偽鏢水蚤的96h-LC50為22.9 ng/mL（18.9，28.1）。由圖1 可知，不同濃度EMB 溶液暴露下，火腿偽鏢水蚤的24h-EC50為16.5 ng/mL。

表2 不同濃度EMB 溶液暴露下火腿偽鏢水蚤的死亡率 （%）

由圖2 可知，隨著EMB 濃度的增加，24 h 內(nèi)火腿偽鏢水蚤成體的呼吸率總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)EMB 濃度在1.25～2.5 ng/mL 范圍內(nèi)時，隨著濃度的增加呼吸率顯著升高；當(dāng)濃度高達(dá)20 ng/mL 時，呼吸率顯著降低。

從圖3 中可以看出，暴露24 h 后，隨著EMB 濃度的升高，火腿偽鏢水蚤的GPx、CAT 和SOD 的活性均發(fā)生顯著變化，而GST 的活性變化不明顯。其中，GPx 的活性一直處于較高水平；CAT 在較低濃度（2.5 ng/mL）時活性較高，在高濃度（10～20 ng/mL）范圍內(nèi)活性受到顯著抑制；SOD 的活性變化趨勢與CAT的正好相反，在低濃度（1.25 ng/mL）下活性較低，在高濃度（20 ng/mL）下活性顯著升高。

2.2 EMB 對火腿偽鏢水蚤的亞慢性毒性

如圖4 所示，隨著EMB 濃度的升高，火腿偽鏢水蚤卵的孵化率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。與對照組相比，在0.02～0.2 ng/mL EMB 濃度下火腿偽鏢水蚤卵的孵化率顯著提高，孵化率由3.3±0.5 個/d 增加至5±0.5 個/d；濃度繼續(xù)升高至0.2～1 ng/mL 范圍內(nèi)，孵化率開始下降；當(dāng)EMB 濃度達(dá)到2 ng/mL 時，火腿偽鏢水蚤卵不能正常孵化。

從圖5A 中可以看出，海水對照和溶劑對照處理下，火腿偽鏢水蚤N1 期無節(jié)幼蟲發(fā)育至橈足幼體C1所需的時間為6 d，存活率和發(fā)育率均為100%；在0.1 ng/mL EMB 處理下，時間縮短至5 d，存活率降至90%，存活的個體均成功發(fā)育為橈足幼體；在高濃度（2 ng/mL）處理下，存活率降至73%，存活個體中僅有85%的個體成功發(fā)育為橈足幼體。這表明不同濃度EMB 暴露下，無節(jié)幼蟲的生長和發(fā)育均受到影響，隨著EMB 濃度升高，無節(jié)幼體存活率和發(fā)育率呈明顯下降趨勢。

從圖5B 中可以看出，海水對照和溶劑對照處理下，橈足幼體C1 發(fā)育為成體C6 所需的時間為13 d，在 0.02～0.1 ng/mL EMB 處理下，其發(fā)育時間縮短至10～ 11 d，在1 ng/mL EMB 處理下，發(fā)育時間延長至15 d；當(dāng)橈足幼體暴露在0.1 ng/mL 及以上濃度下時，隨著濃度的增加，其存活率和發(fā)育率均呈現(xiàn)下降的趨勢，存活率降至30%～50%，存活的個體中發(fā)育率降至30%～40%，當(dāng)濃度高達(dá)2 ng/mL 時橈足幼體幾乎無法存活。

3 討 論

國外關(guān)于EMB 對海洋生物的毒性研究較為普遍。 EMB 對美洲牡蠣（Crassostreavirginica）的96h-LC50為 670 ng/mL，對雜色鳉魚（Cyprinodonvariegatus）的96h- LC50為43 000 ng/mL，對太陽魚（Lepomismacrochirus）的96h-LC50為1 800 ng/mL[14]，對糠蝦（Mysidopsisbahia）的96h-LC50為0.043 ng/mL[15]，對橈足類克氏紡錘水蚤（Acartiaclausi）、偽哲水蚤（Pseudocalanuselongatus）、長角真寬水蚤（Temoralongicornis）及擬長腹劍水蚤（Oithonasimilis）的48 h-EC50為0.12～232 ng/mL[5]。該研究中，EMB 對火腿偽鏢水蚤的96h-LC50為22.9 ng/mL （18.9，28.1），24h-EC50為16.5 ng/mL?；鹜葌午S水蚤屬于對EMB 比較敏感的種類，可作為指示生物用于海洋生態(tài)環(huán)境中EMB 污染物的監(jiān)測。

持續(xù)暴露在物理（溫度、鹽度）和化學(xué)（重金屬、烴類、藻毒素等有毒物質(zhì)）壓力下，水生生物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），過量的ROS 會攻擊蛋白質(zhì)、膜脂、核酸等組分，進(jìn)而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16-18]。 SOD、CAT、GST 及GPx 是抗氧化防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，在保護(hù)機(jī)體免受過量自由基和過氧化物損害等方面發(fā)揮著重要作用[17,19]，可作為氧化脅迫的生物標(biāo)志物[20]。該研究中，不同濃度EMB 暴露下，隨著濃度的升高CAT 的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，SOD 的活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。有學(xué)者指出，較低濃度污染物暴露下，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生SOD 和CAT，可增強(qiáng)機(jī)體消除ROS 的能力，使機(jī)體免受損害，是生物體的一種自適應(yīng)反應(yīng)；當(dāng)污染物濃度繼續(xù)升高，超過了機(jī)體的適應(yīng)能力，作為中毒反應(yīng)的前兆，氧化酶活性就會降低[21-22]。Krishnakumar 等[23]的研究結(jié)果卻正好相反，唐學(xué)璽等[24]學(xué)者在研究蒽對黑鲪超氧化物歧化酶活性的影響時得知在低濃度蒽處理下SOD 活性顯著降低。GPx 以催化過氧化物為底物，反應(yīng)過程中需要有還原性谷胱甘肽（GSH）的參與，有研究表明污染物對水生動物體中的GPx 活性存在誘導(dǎo)作用[25]，且低濃度誘導(dǎo)不明顯，高濃度誘導(dǎo)作用顯著[26]。該研究中，隨著EMB 濃度的升高，GPx 的含量一直處于較高水平。GST 作為Ⅱ相代謝解毒酶也具有過氧化酶的特性，對不同的化學(xué)污染脅迫反應(yīng)不同[27-29]。該研究中，隨著EMB 濃度的升高，GST 的活性并無顯著變化。綜上所述，EMB 暴露下火腿偽鏢水蚤的抗氧化系統(tǒng)受到了明顯的影響。

不同濃度EMB 暴露下，火腿偽鏢水蚤的呼吸率受到明顯影響，隨著濃度的升高，24 h 呼吸率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。有研究表明，在溫度20℃、鹽度15‰的環(huán)境下，火腿偽鏢水蚤呼吸率可達(dá)到 0.58 μL/(ind·h)[30]。該研究中設(shè)定培養(yǎng)環(huán)境為溫度20℃、鹽度20‰，火腿偽鏢水蚤的呼吸率達(dá)到0.68 μL/(ind·h)。低濃度EMB 刺激下，火腿偽鏢水蚤呼吸率可高達(dá)0.96 μL/(ind·h)。這應(yīng)該是其通過提高自身新陳代謝來主動外排體內(nèi)累積的外源污染物質(zhì)。這個過程需要增強(qiáng)呼吸作用以提供充分的能量[31-32]。高濃度EMB刺激下，火腿偽鏢水蚤的呼吸率低至0.37 μL/(ind·h)，說明其呼吸作用直接受到抑制。

污染物長期暴露下，即使?jié)舛容^低，橈足類動物也會出現(xiàn)異常。耗氧量異?？墒贵w內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)和脂肪含量及電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)活力受到影響，能量收支失去平衡，進(jìn)而導(dǎo)致行為表現(xiàn)異常、生長發(fā)育期異常、生長率和繁殖率的變化[33-35]。該研究結(jié)果表明， EMB 對火腿偽鏢水蚤具有慢性毒性效應(yīng)，會影響處于不同生長階段的火腿偽鏢水蚤幼體的生長和發(fā)育。隨著EMB 濃度升高存活率和發(fā)育率呈下降趨勢，在0.02～0.1 ng/mL 的低濃度范圍內(nèi)，EMB 會刺激橈足類的發(fā)育，發(fā)育時間明顯縮短，并且孵化速度明顯增加； 而當(dāng)濃度升至1 ng/mL 時，發(fā)育時間明顯延長。Brown 等[36]在研究殺蟲劑林丹（lindane）對橈足類Bryocamp-tuszschokkei產(chǎn)生的毒性效應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，在較低濃度的污染物暴露下，幼體的數(shù)量有增加的趨勢；Andersen 等[37]和徐東暉等[12]學(xué)者在研究污染物對Acartiatonsa或P.poplesia產(chǎn)生的毒性效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)低濃度污染物刺激可引起產(chǎn)卵率、孵化速度的增高。這可能是由于低濃度污染物會提高橈足類對不利環(huán)境的耐受性，在低濃度污染物的環(huán)境中進(jìn)行長期暴露，橈足類可能會通過調(diào)節(jié)自我生理活動來適應(yīng)不利的環(huán)境[38-39]。隨著污染物濃度的升高，橈足類受到刺激，攝食減少，代謝增加，導(dǎo)致其發(fā)育至成體的時間明顯延長[36]。隨著污染物濃度的繼續(xù)升高，幼體發(fā)育率顯著降低，使橈足類的數(shù)量明顯降低，從而影響該橈足類的種群數(shù)量，導(dǎo)致種群的衰退[35,40]，引起浮游動物群落結(jié)構(gòu)的改變，從而對整個生態(tài)系統(tǒng)造成不利影響。

EMB 可以被橈足類動物主動攝入，也會被動擴(kuò)散至生物體內(nèi)，從而對機(jī)體產(chǎn)生不可逆的毒性作用[5]。盡管目前海洋環(huán)境中的EMB 濃度并不高，平均濃度約為 8.28×10-6ng/mL[5,41]，未影響到海洋浮游生物群落的豐度、結(jié)構(gòu)和功能[6]，但隨著EMB 的大量使用，通過食物網(wǎng)的傳遞，必然會威脅到整個海洋生態(tài)系統(tǒng)乃至人類的健康。因此，對于合理使用EMB 等新型農(nóng)藥以及探討其對海洋生物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)等研究需要更深入地挖掘。