雞胚酶解多肽制備及其在HDF-α 細(xì)胞培養(yǎng)中的初步應(yīng)用

耿 威，李 楊，戰(zhàn)鐵楠，耿曉宇，王莉紅，遲春萍

1.長(zhǎng)春園生肽生物科技有限公司，吉林長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012；3.吉林省正合生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130052；4.長(zhǎng)春生物制品研究所有限公司，吉林長(zhǎng)春 130062

蛋白水解物質(zhì)可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供氮源、多種營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)增殖及貼壁黏附因子類似物等。有研究認(rèn)為蛋白水解物可以為動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)提供氨基酸，并且其中某些特殊活性肽段對(duì)于細(xì)胞增殖、產(chǎn)物表達(dá)等功能具有促進(jìn)作用，短肽可直接進(jìn)入細(xì)胞膜后水解為游離氨基酸，從而為細(xì)胞代謝提供氮源，分子量較大的肽類可以作為生長(zhǎng)因子或保護(hù)劑。

目前，國(guó)外已有針對(duì)多種細(xì)胞系的專用水解物，主要為大豆肽、水解乳蛋白等，但未見(jiàn)到雞胚多肽在細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用。

雞胚即雞的胚胎，是受精雞蛋孵化至一定天數(shù)后，還未破殼完整的生命體。研究表明，雞胚中包含的營(yíng)養(yǎng)成分包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、碳水化合物 (葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、呋喃糖等 )、脂類、脂肪酸等。另外，雞胚中還包括多種生物活性物質(zhì)，小分子活性肽、細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞黏附成分等小分子蛋白質(zhì)。阮光萍等已證實(shí)雞卵清提取液的不同組分對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，但并未研究其水解物的特性。對(duì)于雞胚的酶解多肽在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)雞胚進(jìn)行酶消化裂解后經(jīng)超濾純化獲得相應(yīng)分子量的蛋白肽，并將該多肽添加至細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，以HDF-α 細(xì)胞為模型，對(duì)該活性多肽在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用展開(kāi)了研究，為雞胚酶解蛋白在HDF-α 細(xì)胞培養(yǎng)等中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

胰酶（trypsin，TR，美國(guó)，Sigma 公司）；MTT（美國(guó)，Sigma 公司）；DSMO（美國(guó)，Sigma 公司）；DPPH（美國(guó)，Sigma 公司）；細(xì)胞內(nèi)ROS 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)，Sigma 公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.2 主要儀器

JJ-2 型組織搗碎勻漿機(jī)；VCX130 型超聲破碎儀；AHP-0013 型截留分子量為50KD 的中空纖維柱；K1160 全自動(dòng)凱氏定氮儀；RPLC-MS/MS 系統(tǒng)由Finnigan Surveyor 液相色譜泵、線性離子阱（LTQ）質(zhì)譜組成；Magic C18 AQ 反相色譜填料（5 μm，12 nm）；石英毛細(xì)管（75 μm×120 mm）；PHS-25 型酸度計(jì)；多功能酶標(biāo)儀（TECANGENios）。

1.3 雞胚酶解多肽原液制備

1.3.1 雞胚準(zhǔn)備及活性成分的初步提取

SPF 級(jí)受精雞蛋置37.0±0.5 ℃孵化箱孵化，每2 h 自動(dòng)翻蛋一次，半月后置-20 ℃停止孵化。對(duì)孵化的雞蛋進(jìn)行表面消毒，除蛋殼后取出雞胚在4 ℃下以2 500 r/min 組織勻漿機(jī)勻漿，倒入滅菌后的密封盒中，放到-30 ℃的冷庫(kù)中冷凍72 h，融化后于4 ℃的環(huán)境中對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎，加入等量的注射用水，獲得粗純液，放置于4 ℃的冷藏庫(kù)中備用。

1.3.2 精制提取

取1.3.1 制備的粗純液，調(diào)pH 至7.5，加入胰酶至濃度為2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）50 ℃熱水浴， 水解1 h，在4 ℃下4 500 r/min 離心20 min，上清液超濾過(guò)50 kDa的濾膜，收集50 kDa以內(nèi)的超濾液，調(diào)pH 值至6.8，除菌過(guò)濾為多肽原液。

1.3.3 原液理化性質(zhì)分析

對(duì)1.3.2 獲得的活性多肽原液經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定原液蛋白肽含量，計(jì)算分析制備工藝的收獲率及回收率，經(jīng)shotgun 分析蛋白及肽段組成及各肽段理化性質(zhì)，并對(duì)多肽原液進(jìn)行pH、滲透壓及微生物限度檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)鑒定。

1.4 雞胚酶解多肽在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用研究

將制檢后的原液應(yīng)用于人真皮成纖維細(xì)胞HDF-α（第六代）培養(yǎng)，觀察其增殖情況，并用理化方法處理共同孵育的細(xì)胞，觀察其耐受情況。每項(xiàng)試驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。用SAS9.4 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，Bonferroni 校正（t1、P1 為與對(duì)照比較；t2、P2 為與上一個(gè)劑量組比較）。

1.4.1 促進(jìn)細(xì)胞增殖功能研究

以MTT 法測(cè)定活性多肽對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，將人真皮成纖維細(xì)胞HDF-α（第六代）以1×104個(gè)/ 孔接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，向96 孔板中分別加入含有不同濃度的多肽培養(yǎng)液（0，20，50，100，250， 500 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h 每孔加入20 μLMTT（5 mg/mL），培養(yǎng)結(jié)束后，產(chǎn)生的紫色結(jié)晶用DMSO 溶解，在550 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)定光吸收值。

1.4.2 在紫外損傷模型中雞胚酶解多肽對(duì)細(xì)胞保護(hù)及修復(fù)的作用的研究

將HDF-α 細(xì)胞（第六代）以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，24 h 后，用含有不同濃度的多肽培養(yǎng)液（0，20，50，100，250， 500 μg/mL）處理細(xì)胞，30 min 后，2 000 焦耳的紫外照射細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h 每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）。產(chǎn)生的紫色結(jié)晶用DMSO 溶解，在550 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)定光吸收值。

1.4.3 抗氧化功能研究

通過(guò)ROS 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量來(lái)研究雞胚酶解多肽在細(xì)胞中的抗氧化的功能：將HDF-α 細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后，裝載探針DCFH-DA（10 μm），37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。分別加入含有不同濃度多肽的培養(yǎng)液 （100 μg/mL，200 μg/mL，400 μg/mL），37 ℃孵育 30 min 后，加入200 μm 的H2O2再孵育1 h。收集細(xì)胞，用PBS 重懸細(xì)胞，利用多功能酶標(biāo)儀（TECAN，GENios）測(cè)定這些細(xì)胞的熒光值：激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為：488 nm、525 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚酶解多肽原液理化性質(zhì)分析

經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定，原液蛋白肽的含量為16 mg/mL；經(jīng)計(jì)算收率為91.1%；回收率為93.2%；經(jīng)shotgun 分析，多肽達(dá)300 種之多，分別來(lái)自70 種不同的蛋白；經(jīng)測(cè)定，最終的多肽原液pH 為6.82±0.05，滲透壓為286 mmol/L，微生物限度檢查及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查合格。以上結(jié)果表明，本文所介紹的制備工藝制備的雞胚酶解多肽原液各項(xiàng)理化性質(zhì)符合細(xì)胞培養(yǎng)的條件，可將原液添加至細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行多肽對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)影響的研究。

2.2 雞胚酶解多肽對(duì)HDF-α 細(xì)胞增殖的影響

當(dāng)多肽含量在250 μg/mL 和 500 μg/mL 時(shí)可以顯著促進(jìn)HDF-α 細(xì)胞生長(zhǎng)，其增殖的程度分別為20%和40%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：加入50 μg/mL、100 μg/mL 濃度時(shí)與對(duì)照相比增殖結(jié)果有差異，組間差異不顯著，加入250 μg/mL、500 μg/mL 其對(duì)照、組間相比差異顯著，表明高濃度的原液能更有效的促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

2.3 雞胚酶解多肽在細(xì)胞紫外損傷保護(hù)及修復(fù)模型中的作用

雞胚酶解多肽可較好地保護(hù)HDF-α 細(xì)胞避免紫外損傷，并可促進(jìn)細(xì)胞的紫外損傷修復(fù)，多肽含量在0 ～250 μg/mL 范圍內(nèi)其保護(hù)效果與多肽含量具有量效關(guān)系，當(dāng)含量為250 μg/mL 時(shí)其保護(hù)效果接近100%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：當(dāng)加入50 μg/mL以上濃度與對(duì)照比差異就不顯著了，說(shuō)明該濃度原液的加入細(xì)胞即可抵抗紫外的損傷；最高濃度與前一個(gè)劑量組相比具有差異性，說(shuō)明該劑量保護(hù)效果比前一個(gè)劑量組具有更好的細(xì)胞保護(hù)作用。

2.4 雞胚酶解多肽抗細(xì)胞內(nèi)氧自由基功能

細(xì)胞內(nèi)抗自由基試驗(yàn)顯示：100 μg/mL 活性多肽溶液能夠高效消除H2O2產(chǎn)生的自由基，其消除效率高達(dá)77%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：與對(duì)照組差異非常顯著，表明加入100 μg/mL 多肽原液即可有效的抵抗H2O2對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響；隨原液加入濃度的增加各組也有顯著性差異，可能的原因是加入的多肽原液因細(xì)胞增殖較多引起的熒光值的升高。

3 討 論

細(xì)胞的生長(zhǎng)主要與培養(yǎng)基中的氨基酸含量、生長(zhǎng)因子等有關(guān)，蛋白酶解多肽的添加主要為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了氮源、碳源及生長(zhǎng)和黏附因子等，這種天然多肽產(chǎn)物的添加照普通培養(yǎng)基提供的培養(yǎng)條件更有利細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、細(xì)胞間的黏附及細(xì)胞增殖，并且蛋白的酶解產(chǎn)物含有的多肽及蛋白分子量較小，也去除了免疫蛋白及補(bǔ)體蛋白，照普通培養(yǎng)添加的血清更為安全，現(xiàn)普遍研究的為大豆蛋白酶解產(chǎn)物，乳清蛋白酶解產(chǎn)物，也被制成商品化的制品添加至特定的培養(yǎng)基中供特定的細(xì)胞培養(yǎng)使用，通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)卵清蛋白酶解產(chǎn)物在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用也有學(xué)者進(jìn)行過(guò)研究，但對(duì)于雞胚酶解多肽在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用卻未曾見(jiàn)到。

雞胚即雞的胚胎，是受精雞蛋孵化至一定天數(shù)后，還未破殼完整的生命體。雞胚照普通的雞蛋相比，含有更多的促進(jìn)細(xì)胞增殖分化表達(dá)的蛋白質(zhì)及蛋白肽，也含有更多的細(xì)胞生長(zhǎng)因子及細(xì)胞黏附因子，其酶解產(chǎn)物也更加適合添加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，起到促進(jìn)細(xì)胞增殖分化及保護(hù)細(xì)胞的作用。

HDF-α 細(xì)胞即人皮膚成纖維細(xì)胞，是皮膚真皮網(wǎng)織層中最重要的細(xì)胞，是皮膚衰老和細(xì)胞受損后的主要修復(fù)細(xì)胞，它不但能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，還能分泌大量的膠原蛋白、彈性纖維蛋白及多種細(xì)胞修復(fù)因子，具有強(qiáng)大的自我更新能力，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的影響較為敏感，廣泛應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞增殖、修復(fù)的影響的研究中，HDF-α 細(xì)胞更適合作為模型來(lái)研究雞胚酶解多肽對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞損傷修復(fù)的影響。

本文制備出了分子量小于50kDa 的雞胚酶解多肽原液，經(jīng)鑒定各項(xiàng)指標(biāo)符合細(xì)胞培養(yǎng)要求，將該原液添加至HDF-α 細(xì)胞培養(yǎng)液中，證明該酶解多肽可有效的促進(jìn)HDF-α 細(xì)胞增殖，并且在細(xì)胞紫外線損傷保護(hù)修復(fù)模型中，該活性肽溶液表現(xiàn)出較好的保護(hù)效果。紫外線損傷主要表現(xiàn)在使細(xì)胞染色體DNA 及RNA 等遺傳物質(zhì)受到損傷，引起細(xì)胞死亡，也可因紫外線作用產(chǎn)生O3，形成更多氧自由基，引起細(xì)胞蛋白及遺傳物質(zhì)的變性，從而殺死細(xì)胞，而雞胚酶解多肽中含有一些蛋白肽及還原性的氨基酸可幫助細(xì)胞進(jìn)行遺傳物質(zhì)的修復(fù)，并可抵抗氧自由基的損傷，為驗(yàn)證，本文設(shè)立了抗氧自由基的試驗(yàn)，結(jié)果證明酶解多肽能夠高效消除H2O2產(chǎn)生的氧自由基，其消除效率可高達(dá)77%，有效的保護(hù)了HDF-α 細(xì)胞免受氧自由基的損傷。

本文以HDF-α 細(xì)胞作為模型，研究了雞胚酶解多肽對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，及保護(hù)細(xì)胞抵抗紫外及氧自由基的損傷的作用，為雞胚酶解多肽應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：略