小鵝瘟診斷技術(shù)研究進(jìn)展

張淑瑩，阮洪玲，文雙云，盧松巖

1.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林長春 130062；2.長春市雙陽區(qū)畜牧總站，吉林長春 130600；3.吉林市船營區(qū)畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究會(huì)，吉林吉林市 132012

小鵝瘟又稱鵝細(xì)小病毒感染，也稱德茲西式病。感染的主要對象是雛鵝和雛番鴨，以3～20日齡最易感染，傳播速度快，且以大面積爆發(fā)的流行趨勢出現(xiàn)。感染后臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振，昏睡，嚴(yán)重腹瀉，病鵝出現(xiàn)稀糞，瀕死前有明顯神經(jīng)癥狀出現(xiàn)，頸部發(fā)生較大程度扭轉(zhuǎn)，解剖后可見肝臟發(fā)生明顯腫大，質(zhì)地脆化，顏色呈古銅色，膽囊、腎臟腫脹，輸尿管可見尿酸鹽沉積。典型病例解剖病變樣本可見小腸黏膜有大片壞死脫落和凝固，形成灰色或淡黃色的栓塞物，形如臘腸狀，將腸管全部堵塞。

1956 年，方定一等人發(fā)現(xiàn)此病，并于1961年成功從病死雛鵝體中分離到病毒毒株，同時(shí)證明是一種新的病毒，將其暫定名為“小鵝瘟”。1966年，匈牙利科學(xué)家德茲西在鵝胚中分離到小鵝溫病毒毒株。1974年，世界家禽協(xié)會(huì)將該病命名為德茲西式病。時(shí)至今日，我國小鵝瘟的首次研究內(nèi)容被國際禽類巨作《禽病學(xué)》引用。近年來，對小鵝瘟診斷技術(shù)的研究不斷創(chuàng)新，在特異性更強(qiáng)的免疫學(xué)和分子生物學(xué)方面不斷取得技術(shù)突破。本文就小鵝瘟診斷技術(shù)研究成果進(jìn)行綜述，為后續(xù)研究提供參考。

對于小鵝瘟的診斷，常見的方法可歸納為病毒的分離、檢測和鑒定與血清特異性抗體的檢測兩類。最早建立的檢測方法是瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2018年5月7日發(fā)布了新修訂的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 560-2018《小鵝瘟診斷技術(shù)》，適用于小鵝瘟病毒分離、病毒分離株的鑒定、鵝群小鵝瘟檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和免疫鵝群抗體水平的檢測，對小鵝瘟診斷的科學(xué)、準(zhǔn)確、規(guī)范起到了積極地促進(jìn)作用。

1 病毒的分離、檢測和鑒定

1.1 病毒的分離

無菌環(huán)境下取病死雛鵝的肝、脾、腸等內(nèi)臟器官剪碎磨細(xì)，用滅菌生理鹽水或PBS 制成乳劑，接種在鵝胚或番鴨胚尿囊腔內(nèi)。翌日無菌收集尿囊液，盲傳一代。隨著病毒細(xì)胞傳代數(shù)量增加，培養(yǎng)3～5d 后，肉眼觀察可見胚體病變越來越明顯，規(guī)律性越來越強(qiáng)，絨尿膜增厚，翅尖、趾、胸部毛孔、頸、喙均有嚴(yán)重出血點(diǎn)，頭部皮下水腫。胡桂學(xué)等人[1]根據(jù)病毒粒徑和外部形態(tài)特征，在電子顯微鏡下進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染觀察，可見聚集狀態(tài)的病毒粒子，這是因?yàn)樵诎l(fā)病初期小腸帶有一定數(shù)量的病毒粒子，到發(fā)病后期，機(jī)體產(chǎn)生了抗體，而病毒粒子與抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，使病毒粒子發(fā)生聚集，從而有利于對分離到的小鵝瘟病毒粒子進(jìn)行電鏡觀察，該方法檢測準(zhǔn)確、快速，但是操作具有一定難度且成本較高，不適合在基層應(yīng)用。

1.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是檢測小鵝瘟病毒最經(jīng)典的方法之一。 其原理是將瓊脂凝膠作為抗原擴(kuò)散，與陽性血清發(fā)生反應(yīng)的載體，當(dāng)待檢抗原孔與陽性血清孔之間出現(xiàn)沉淀線，且與標(biāo)準(zhǔn)抗原沉淀線末端相吻合，判為陽性；無沉淀線出現(xiàn)，判為陰性。同樣的試驗(yàn)原理，使用標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，可以檢測血清特異性抗體。秦愛建等人[2]成功建立免疫酶瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法，用于檢測鵝胚尿囊液中的小鵝瘟病毒抗原，以及經(jīng)過免疫的鵝的抗體水平，其靈敏度是普通瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的236 倍。2004年11月17日，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1467-2004《小鵝瘟病毒分離和瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法》。該方法準(zhǔn)確率高、操作簡捷、成本低廉，適合在基層應(yīng)用。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

1966 年，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)首次用于液體樣品中微量物質(zhì)的測定，酶的催化頻率很高，放大反應(yīng)效果，因此具有很高的敏感度。近年來，先后建立了斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、親和素-生物素-酶復(fù)合物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法檢測小鵝瘟病毒，具有敏感、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)，是重要的診斷方法之一。

1.4 冰凍切片免疫熒光方法

采集病死鵝肝臟、腸管、脾臟等割成小塊，包埋劑覆蓋，速凍后進(jìn)行切片，用丙酮乙醇溶液固定。將冰凍切片置于含有小鵝瘟單克隆抗體的PBS 中水浴，洗滌后置于FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG中水浴孵育，洗滌后加入50%甘油PB 封片。熒光顯微鏡下觀察，見亮綠色熒光即為陽性，未見熒光即為陰性。該方法在檢測過程中，應(yīng)與已知陽性和陰性冰凍切片共同操作，建立標(biāo)陰標(biāo)陽，對檢測過程進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡稱PCR。采集病死鵝肝臟、腸管、脾臟等研磨，提取DNA，通過PCR 儀擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最后由紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果[3]。樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳出現(xiàn)776 bp 目標(biāo)條帶即為陽性，無擴(kuò)增條帶為陰性。趙妍等人[4]成功建立雙重PCR 方法檢測小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒，提高了檢測效率，為多病種同步鑒別診斷提供了思路。

2 血清特異性抗體的檢測

2.1 中和試驗(yàn)

抗體與病毒特異性結(jié)合，抑制其對敏感細(xì)胞的吸附、穿入和脫殼，從而抑制增殖，失去感染性和致病力。鵝胚接種樣品和不同濃度的小鵝瘟病毒，觀察生長發(fā)育情況，計(jì)算半數(shù)鵝胚致死量和中和指數(shù)進(jìn)行結(jié)果判定。同樣的試驗(yàn)原理，使用抗小鵝瘟高免血清，可以鑒定是否為小鵝瘟病毒感染。該方法不但可以定性，還可以定量，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，但是檢測周期長，在臨床應(yīng)用上，不適合批量檢測。

2.2 免疫熒光試驗(yàn)

制備小鵝瘟病毒抗體檢測板，加入稀釋的樣品和標(biāo)陰標(biāo)陽血清，水浴并洗滌，加入抗鵝IgG 單克隆抗體，水浴并洗滌，加入FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，水浴并洗滌，加入50%甘油PB 覆蓋。熒光顯微鏡下觀察，見亮綠色熒光即為陽性，未見熒光即為陰性。郭卉等人[5]成功建立間接免疫熒光法檢測小鵝瘟病毒，由于二抗的信號放大效應(yīng)，相較直接免疫熒光法而言就有更高的敏感性。

3 展望

從小鵝瘟的傳播途徑和主要侵害對象來看，凈化尤其是種源環(huán)節(jié)凈化是最佳防控手段。疫病的凈化是通過監(jiān)測來實(shí)現(xiàn)的，監(jiān)測對診斷技術(shù)的要求就是：采樣方便、檢測快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉。面對小鵝瘟凈化過程中，高頻率、多批次、大通量的檢測任務(wù)，現(xiàn)有的檢測方法稍顯不足。未來將進(jìn)一步推動(dòng)相應(yīng)探索，隨著對小鵝瘟研究的不斷深入，生物工程學(xué)的不停發(fā)展，檢測方法的持續(xù)進(jìn)步，相信小鵝瘟診斷技術(shù)將會(huì)取得突破性進(jìn)展，服務(wù)于生產(chǎn)實(shí)際，促進(jìn)養(yǎng)鵝業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。