豬流行性腹瀉病毒氨基肽酶N受體研究進展

宋利娜，劉沂霖，任 銳，蘇 雙，尹榮蘭*

1.吉林大學動物醫(yī)學院，吉林長春 130062；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，吉林長春 130062

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種仔豬急性水樣腹瀉、嘔吐、脫水導致電解質失衡而死亡的一種疾病。1978年比利時根特大學科學家根據(jù)科赫原則首次證明冠狀病毒為豬病毒腹瀉的病原。1982年PEDV首次在亞洲報道，2012年，PEDV再次席卷中國，與歐洲豬場病癥相比，亞洲豬場仔豬致死率更高，且流行較廣。2013年美國首次報道該病發(fā)生，一年內造成800萬頭仔豬病死，并迅速傳至加拿大和墨西哥，隨后PEDV在亞洲其他國家爆發(fā)，如韓國、日本。

1 PEDV結構

PEDV為直徑95～190 nm的冠狀病毒屬α冠狀病毒科病毒，PEDV基因組約為28 kb的單股正鏈RNA，包括5’帽子和3’poly尾巴，5’UTR和3’UTR及7個開放閱讀框，包括四個結構蛋白（纖突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N），其中S蛋白與宿主靶細胞受體結合介導病毒入侵和誘導產生中和抗體。

病毒與細胞受體的相互作用作為病毒生命周期的第一步，也是至關重要的一步，病毒與受體結合使病毒進入細胞復制增殖。冠狀病毒科包含多種重要的病毒，感染譜較廣，感染人類和動物，引起呼吸道和腸胃疾病。冠狀病毒有多種細胞受體已被鑒定，包括癌胚抗原相關細胞粘附分子1、血管緊張素轉換酶2和氨基肽酶N(APN)。例如，α冠狀病毒屬人類冠狀病毒NL63使用血管緊張素轉換酶2作為其進入細胞的受體。ACE2受體較早被鑒定為β冠狀病毒屬急性呼吸綜合征冠狀病毒的功能性受體。鼠肝炎病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒通過與癌胚抗原細胞粘附分子和雙肽酶4結合介導病毒感染。一些冠狀病毒，包括人類冠狀病毒OC43和牛冠狀病毒使用乙?；僖核嶙鳛槭荏w介導病毒入侵感染。

2 氨基肽酶N (APN)

氨基肽酶N作α冠狀病毒的主要受體，如豬傳染性胃腸炎病毒，人類α冠狀病毒229E，貓傳染性腹膜炎病毒和犬冠狀病毒利用氨肽酶N作為受體。PEDV利用APN作為一種細胞受體介導病毒入侵感染。受體結合和進入細胞是病毒感染宿主細胞的必要步驟，導致病毒內化，促進病毒增殖復制。PEDV的宿主特異性、組織嗜性是由病毒的S蛋白與受體相互作用決定的。受體相互作用在冠狀病毒的細胞和組織嗜性以及發(fā)病機制和跨物種傳播中起著至關重要的作用。

2.1 氨基肽酶N的結構

氨基肽酶N是一種II型鋅金屬蛋白酶，APN糖蛋白主要表達在腎臟、小腸、呼吸道上皮細胞上，可以被胰蛋白酶裂解成N端(95 kDa)和C端(50 kDa)兩個蛋白，APN是一種鋅依賴的蛋白酶，通過HELAH基序介導活性肽的N端氨基酸的分裂，以發(fā)揮酶的活性。APN還發(fā)揮著受體和信號分子的作用。PEDV感染細胞中，金屬蛋白酶ADAM17通過改變氨基肽酶N調節(jié)豬流行性腹瀉病毒感染。APN有7個結構域，第一個結構域在N端(aa17)上形成一個短的細胞質尾部，結構IV從71～252 aa，肽酶活性由域V和域VI(253～558 aa)所包含。VII域位于C端的由 581～967 aa組成的。

2.2 APN與PEDV感染

APN介導多種生命過程，包括抗原呈遞、細胞分化、細胞運動和冠狀病毒進入。豬APN在腸道刷狀緣膜上大量表達。此外，它還表達在腎臟和呼吸道的上皮細胞表面。pAPN最初被確定為豬傳染性胃腸炎病毒的主要受體。在豬體內，體外轉染和表達pAPN可以使MDCK細胞株感染PEDV，說明pAPN可能也是PEDV的受體。此外，將pAPN使用CRISPRCas9技術將其轉入至小鼠體內，小鼠對PEDV具有易感性。MDCK細胞外源表達hAPN或pAPN使其具有易感性，提示PEDV-APN相互作用不具有物種特異性。此外，PEDV可以感染人、猴、豬、蝙蝠等多種細胞系。Vero細胞常被用于PEDV毒株的分離和繁殖，然而，Vero細胞蛋白組質譜分析并無APN表達，細胞中缺乏mRNA轉錄本，這表明其他受體可能參與了PEDV進入細胞。有學者質疑pAPN作為功能受體的作用。最新研究表明，APN不是PEDV進入病毒所必須的受體。到目前為止，尚缺乏直接證據(jù)表明在體外pAPN與PEDV S蛋白相互作用。雖然背后的機制尚未被破譯，但人們很容易推測，pAPN的表達水平可能與PEDV感染有關。

2.3 APN與冠狀病毒感染

冠狀病毒利用多種細胞蛋白作為細胞進入的功能受體，例如錨定在S蛋白介導冠狀病毒進入細胞。S蛋白裂解成受體結合S1亞基和膜融合S2亞基組成。S1亞基中的兩個區(qū)域，稱為S1-NTD和S1-CTD，在一些冠狀病毒中可能作為受體結合區(qū)域，APN結合域最近被證明位于PEDV S1的c端半?yún)^(qū)域(aa477～629)，對應于TGEV S1的RBD(aa505～655)。有趣的是，盡管被認為共享同一受體，但在已知對APN結合起關鍵作用的TGEV RBD延伸環(huán)內的兩個芳香殘基在PEDV RBD中并未保守，這表明受體相互作用的模式不同。

2.4 APN與跨種傳播

與TGEV不同，PEDV與hAPN相互作用并利用hAPN作為受體。此外，PEDV還可以在體外感染除豬外的不同物種的多個細胞系，包括蝙蝠和靈長類動物(人類和非人類)。PEDV的基因組序列和基因組與蝙蝠α-冠狀病毒的關系要大于與同一屬的其他病毒的關系，這表明蝙蝠和豬之間可能已經發(fā)生了跨種傳播，可能是通過其他的中間宿主。

3 PEDV 與其他受體

除了與APN相互作用外，PEDV還能與唾液酸結合。α-冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒都可以結合唾液酸。研究表明，PEDV的唾液酸結合位點被證明發(fā)生在S蛋白的N端區(qū)域(aa1～320)，這一發(fā)現(xiàn)與其他冠狀病毒唾液酸結合位點一致。然而，目前尚不清楚S蛋白結合唾液酸是否能促進PEDV進入細胞。APN招募TGEV S1能通過其N端區(qū)(aa21～244)與唾液酸(N-乙酰神經氨酸，Neu5Ac)和N-糖基神經氨酸結合。唾液酸結合活性在細胞培養(yǎng)中對TGEV在較短的接種條件下會增強感染。使用家兔紅細胞證實PEDV具有血凝(HA)活性，但這種HA活性僅在用胰蛋白酶或神經氨酸酶預處理病毒后才能觀察到。研究證明PEDV S1可以與牛和豬的黏液結合。此外，N-乙酰神經氨酸/唾液酸對PEDV S1表現(xiàn)出最高的結合親和力。還有研究表明硫酸肝素作為S蛋白的結合位點協(xié)助病毒進入。其是否可作為功能受體介導病毒進入有待確定。

4 總結

受體相互作用在冠狀病毒的細胞和組織嗜性以及發(fā)病機制和跨物種傳播中起著至關重要的作用。APN作為α-冠狀病毒的受體，其作用機制仍然不清楚，現(xiàn)有研究已證明其不是PEDV感染Vero和小腸上皮細胞所必須的功能受體?？赡艽嬖谥渌墓δ苁荏w，研究表明，整合素蛋白和轉鐵蛋白受體蛋白均在PEDV感染過程中明顯增加，是否可以作為PEDV的功能受體有待研究證實，所以了解APN的結構功能為PEDV的功能受體鑒定及疫苗的研發(fā)奠定基礎。

參考文獻：略