高效液相色譜法測定微球中硫酸小檗堿的含量

朱慶賀，王麗坤，張艷，楊旭東，王爽，陳曦，王觀悅，穆永才，羅天瑤，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾161005)

硫酸小檗堿(Berberine Sulfate)是由含有小檗堿的植物中提取的一種生物堿，在黃連、黃柏、三顆針等植物中含量豐富。硫酸小檗堿具有清熱解毒、抗感染等功效[1]，與甲氧芐胺及抗菌肽等合用對大腸桿菌等細(xì)菌有協(xié)同作用[2-4]，有研究表明硫酸小檗堿對豬輪狀病毒有一定抑制作用[5]，獸醫(yī)臨床中常用于動(dòng)物細(xì)菌性腸炎、各種化膿性感染的治療。載藥體系微球制劑具有高效無毒、釋藥速率恒定以及粒徑可控的優(yōu)點(diǎn)[6]，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院獸藥研究室結(jié)合硫酸小檗堿及微球特性制備了硫酸小檗堿微球制劑，為進(jìn)一步進(jìn)行硫酸小檗堿含量檢測需要，建立了微球中硫酸小檗堿含量的高效液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 硫酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(含量98.0%，中國食品藥品檢定研究院)；硫酸小檗堿微球制劑(規(guī)格：2%，自制)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；無水乙醇(分析純，天津市百世化工有限公司)。

1.1.2 儀器 電子分析天平，MS104TS/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司；高效液相色譜儀，LC-20AT SPD-20A，SHIMADZU；純水儀，XYE2-20-H型，北京湘順源科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，F(xiàn)E20型，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；注溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長349 nm；檢測器：SPD-20A；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相：乙腈：水(45∶55)。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對照品溶液 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的硫酸小檗堿對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成98 μg/mL的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液 按照配方比例制備硫酸小檗堿微球制劑，精密取樣品適量(相當(dāng)于硫酸小檗堿10 mg)，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相充分溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取此液1 mL置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。

1.2.2.3 陰性對照品溶液 按配方比例量取與供試品溶液相當(dāng)?shù)幕|(zhì)溶液(與硫酸小檗堿微球制劑相比只是不含硫酸小檗堿，其他成分相同)適量，按照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

1.2.3 系統(tǒng)專屬性考察 分別取硫酸小檗堿對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定。

1.2.4 方法檢測限與定量限 取供試品溶液加流動(dòng)相稀釋，分別配制成0.001，0.002，0.004，0.008和0.016 μg/mL濃度的檢測樣品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。測得基線噪音值，按信噪比S/N≥3確定方法的檢測限(LOD)，按按信噪比S/N≥10確定方法的定量限(LOQ)。

1.2.5 線性試驗(yàn) 精密量取對照品儲備液適量，分別置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度分別為0.098、0.98、4.90、24.50、49.00 μg/mL的系列對照品溶液。按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積(y)對硫酸小檗堿的濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸方程。

1.2.6 回收率測定 取1.2.2項(xiàng)下制備的儲備液，分別精密量取適量并添加配方劑量的空白基質(zhì)，用流動(dòng)相稀釋成低(L=0.98 μg/mL)、中(M=24.50 μg/mL)、高(H=49.00 μg/mL)3 種理論濃度的對照品，每個(gè)濃度配制 3 份，按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，并利用外標(biāo)法計(jì)算其含量。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 取1.2.2項(xiàng)制備的儲備液適量，用流動(dòng)相稀釋成24.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測定其峰面積。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.2.2項(xiàng)制備的儲備液適量，用流動(dòng)相稀釋成24.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h測定其峰面積。

1.2.9 樣品含量測定 精密量取批號為20151101、20160125、20170607的3批次的硫酸小檗堿微球樣品適量，每批次3份，按1.2.2項(xiàng)制成供試品溶液，分別進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)專屬性考察 分別取硫酸小檗堿對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果見圖1。在該色譜條件下，硫酸小檗堿的保留時(shí)間k為26.9 min左右，陰性對照在此時(shí)間附近沒有出峰，因此，對硫酸小檗堿HPLC的測定沒有影響，專屬性能滿足檢測要求。

2.2 方法檢測限、定量限的確定 按信噪比S/N≥3確定檢測限(LOD)，按信噪比S/N≥10確定其定量限(LOQ)。經(jīng)測定，本方法對硫酸小檗堿微球制劑中硫酸小檗堿的LOD為0.001 μg/mL，LOQ為0.002 μg/mL。

2.3 線性試驗(yàn) 配制0.098、0.98、4.90、24.50、49.00 μg/mL的系列對照品溶液，分別按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積(y)對硫酸小檗堿的濃度(x，μg/mL)進(jìn)行線性回歸方程，得回歸方程為y=64832x+47399，R2=0.9991。結(jié)果表明硫酸小檗堿在0.098～49.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)。

圖2 硫酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 回收率測定 分別測定低(L=0.98 μg/mL)、中(M=24.50 μg/mL)、高(H=49.00 μg/mL)3 種理論濃度的對照品溶液的峰面積,并計(jì)算其實(shí)測濃度，結(jié)果表明高、中、低濃度對照品溶液中硫酸小檗堿的平均回收率為98.98%，該方法回收率符合要求(表1)。

表1 硫酸小檗堿的回收率

回收率R% = 實(shí)測濃度/理論濃度 × 100%

2.5 精密度試驗(yàn) 制備得24.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積分別為1849872、1796579、1846351、1860479、1851674、1847562。計(jì)算RSD為1.24%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備得24.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.1項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h測定其峰面積分別為1849852、1896754、1846851、1861456、1844598、1857562，平均峰面積為1859512，RSD為1.04%，表明樣品在12 h內(nèi)含量穩(wěn)定。

2.7 樣品含量測定 批號為20151101、20160125、20170607的3批樣品中硫酸小檗堿平均含量分別為標(biāo)示量的98.18%、101.41%、103.29%，符合規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件 應(yīng)用二級陣列檢測器對對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得知，硫酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在229、349 nm處有最大吸收峰，另外，參考文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]得知，小檗堿在349 nm為常用紫外測定波長。因此,選擇349 nm波長下測定硫酸小檗堿微球制劑中硫酸小檗堿的含量。通過色譜結(jié)果的比較分析，在349 nm波長下測定，能夠獲得最大的靈敏度和抗干擾能力，本試驗(yàn)中選擇349 nm作為硫酸小檗堿含量的檢測波長。試驗(yàn)中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明，乙腈-水在經(jīng)過比例調(diào)試(45∶55)后分離效果最好，分離得到的硫酸小檗堿峰型良好，無拖尾現(xiàn)象，分離度大，因此,選擇乙腈-水(45∶55)為檢測流動(dòng)相。

3.2 小檗堿的含量檢測方法 小檗堿的主要成鹽形式包括鹽酸鹽和硫酸鹽，鹽酸小檗堿作為臨床中常用中藥成分，研究較多。而硫酸小檗堿在獸醫(yī)臨床領(lǐng)域，尤其是制劑含量檢測方面文獻(xiàn)較少。因此，建立硫酸小檗堿的含量檢測方法對于硫酸小檗堿的藥物規(guī)范化應(yīng)用具有重要意義。李華芩[10]等首先利用分光光度計(jì)法建立了注射液中硫酸小檗堿含量檢測方法，該方法適用于企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)品的質(zhì)量控制。之后又利用HPLC建立了注射液中硫酸小檗堿的含量檢測方法，但由于未購得硫酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，所以用鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行代替[7]。本研究因劑型優(yōu)化，制備了硫酸小檗堿微球制劑，但尚無微球制劑中硫酸小檗堿的含量檢測方法，因此,本試驗(yàn)利用HPLC建立了微球中硫酸小檗堿的含量檢測方法，為以后硫酸小檗堿微球制劑的含量檢測提供技術(shù)支持。

本實(shí)驗(yàn)室成功研制了硫酸小檗堿微球制劑，兼具了硫酸小檗堿和微球制劑的共同優(yōu)點(diǎn)，是獸醫(yī)臨床中一種良好的長效緩釋劑型[6]。為了這一新劑型的更好應(yīng)用，建立了硫酸小檗堿的HPLC檢測方法，本方法分離度好，硫酸小檗堿的保留時(shí)間在26.9 min左右，峰形好，基本無拖尾，雜質(zhì)不干擾實(shí)驗(yàn)測定，而且采用外標(biāo)法測定硫酸小檗堿微球的含量操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，回收率高，重現(xiàn)性好，可以為微球中硫酸小檗堿含量的檢測提供參考。