嗜熱鏈球菌等六種微生物對(duì)AFB1 降解能力的研究

■趙雪芹 朱風(fēng)華 陳 甫 邊學(xué)偉 朱連勤*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109)

霉菌毒素是霉菌產(chǎn)生的有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物，據(jù)報(bào)道目前已知的霉菌毒素有300多種，這些毒素對(duì)人和動(dòng)物都具有潛在的毒性[1]，不僅嚴(yán)重影響畜禽生產(chǎn)性能，還可殘留在畜禽體內(nèi)各組織器官，從而影響動(dòng)物源性食品的安全。黃曲霉毒素B1（AFB1）是飼料中最常見(jiàn)的霉菌毒素之一。2019年，朱風(fēng)華等采集山東省各地飼料原料2 237份及配合飼料1 432份進(jìn)行霉菌毒素檢測(cè)，結(jié)果顯示，飼料原料中AFB1污染率為39.20%，超標(biāo)率為7.18%；配合飼料中AFB1污染率為45.88%，超標(biāo)率為2.74%[2]。黃俊恒等對(duì)全國(guó)19省市飼料及飼料原料的檢測(cè)結(jié)果顯示，餅粕類樣品受AFB1污染最為嚴(yán)重，超標(biāo)率為13.2%，超標(biāo)樣品AFB1 含量的均值為49.5 μg/kg[3]。動(dòng)物采食了含有AFB1的飼料后通常出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、飼料利用率降低、產(chǎn)蛋量和產(chǎn)奶量下降、繁殖率降低的現(xiàn)象。AFB1具有肝臟毒性，靶器官為肝臟[4]，還可引起動(dòng)物免疫抑制[5]。常用的霉菌毒素脫毒方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法和化學(xué)法由于本身的實(shí)施過(guò)程或者所用試劑存在諸多缺點(diǎn)，而且不能徹底去除霉菌毒素，不能在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。微生物降解法是近幾年來(lái)研究的熱點(diǎn)，相比物理法和化學(xué)法微生物降解具有效率高、特異性好、不影響飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)。

本研究為了探索益生菌作為生物脫毒方法對(duì)飼料中AFB1的降解效果，選擇了遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌、乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌、米曲霉6 種飼料中允許添加的微生物分別檢測(cè)其對(duì)AFB1 的降解效果和降解產(chǎn)物，并研究了高效降解菌株在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)霉變飼料的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

10365 遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、22096 短小芽 孢 桿 菌(Bacillus pumiluss)、2013 米 曲 霉(Aspergil?lus oryzae)、10344 乳酸片球菌(Pediococcus acidilacti?ci)、6063嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、6226羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑

黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素M1（AFM1）、黃曲霉毒醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；乙腈（色譜純）。LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PDB 培養(yǎng)基、TPY 培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)菌株準(zhǔn)備

在無(wú)菌操作臺(tái)中，將所需的菌株分別接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，遲緩芽孢桿菌及短小芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基，米曲霉接種于PDB培養(yǎng)基，乳酸片球菌接種于MRS 培養(yǎng)基，嗜熱鏈球菌及羅伊氏乳桿菌接種于TPY 培養(yǎng)基。相應(yīng)溫度下120 r/min 培養(yǎng)24 h，按4%的接種量分別接種到裝有5 ml相應(yīng)液體培養(yǎng)基的試管中，120 r/min相應(yīng)溫度下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，重復(fù)以上操作直至菌體活力充分恢復(fù)。利用分光光度計(jì)和平板計(jì)數(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行活菌檢測(cè)，繪制生長(zhǎng)曲線。將活化后的所試菌株，按4%的接種量接種到5 ml相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)18～20 h；并按照菌體生長(zhǎng)曲線調(diào)整到供試菌懸液的濃度108CFU/ml。

1.4 高效降解AFB1菌株篩選

AFB1 純品溶解于乙腈溶液，制成100 μg/ml 母液，分別配置0、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1 μg/ml AFB1溶液，制定AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1%的菌液的混懸液添加到含有AFB1 的4 ml培養(yǎng)基中，終濃度為0.5 μg/ml，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中適宜溫度下震蕩培養(yǎng)24 h。對(duì)照組只含有毒素，每種菌設(shè)4個(gè)重復(fù)。前處理：取樣品1 ml菌液，-80 ℃冰箱冷凍4 h，冷凍干燥24 h，用84%的乙腈水1 ml 復(fù)溶。之后將溶液通過(guò)0.22 μm 的有機(jī)相膜轉(zhuǎn)入空的液相瓶中，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法進(jìn)行樣品分析。降解率(%)=[（對(duì)照組毒素含量-處理組毒素含量）÷對(duì)照組毒素含量]×100。

1.5 嗜熱鏈球菌降解AFB1的產(chǎn)物分析

將篩選所得的高效降解菌株與AFB1 共培養(yǎng)，方法同1.4 節(jié)。AFM1、黃曲霉毒醇純品溶解于乙腈溶液，制成100 μg/ml母液，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。分別配置0、0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1 μg/ml AFB1溶液，制定毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照1.4 節(jié)進(jìn)行樣品前處理，采用HPLC-MS方法進(jìn)行降解產(chǎn)物分析。

1.6 篩選嗜熱鏈球菌降解霉變飼料中AFB1 的最佳發(fā)酵條件

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，設(shè)定4個(gè)試驗(yàn)因素：發(fā)酵時(shí)間（X1）、水分含量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）、接種菌量（X4），設(shè)計(jì)4因素5水平的二次回歸正交試驗(yàn)。通過(guò)進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定AFB1發(fā)酵因素設(shè)定范圍為發(fā)酵時(shí)間72～120 h、含水量55%～65%、接種量6～10×108CFU/g、發(fā)酵溫度43～44 ℃。AFB1因子水平編碼如表1。采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中rsreg多項(xiàng)式的回歸模型和反應(yīng)面分析程序，建立4因素5水平的回歸方程，選取54個(gè)方案因變量最大預(yù)測(cè)值為最佳方案。

1.7 發(fā)酵條件驗(yàn)證

配制20 kg玉米-餅粕混合飼料（60%玉米、20%豆粕、10%花生粕、5%棉籽粕、5%DDGS），加一定量的水混勻，放置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)28 d。取霉變飼料，60 ℃烘干恒重。磨碎，過(guò)40目篩，稱取5 g，加入50 ml錐形瓶中，再向錐形瓶中加20 ml 84%乙腈水，加塞，放置搖床里37 ℃、120 r/min、2 h。過(guò)濾到離心管中。根據(jù)預(yù)測(cè)值的發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)3次重復(fù)，采用HPLC-MS方法檢測(cè)發(fā)酵后霉變飼料中AFB1含量。

表1 AFB1發(fā)酵霉變飼料因子水平編碼

1.8 質(zhì)量控制

精密度試驗(yàn)：取濃度為1 μg/ml的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄AFB1 的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.35%。

回收率試驗(yàn)：在空白培養(yǎng)基樣中分別添加0.25、0.5、1 μg/ml不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述處理方法進(jìn)行樣品處理之后上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次?；厥章史謩e為95.5%、98.1%、96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.29%、1.97%、2.76%。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用EXCEL進(jìn)行初步處理，采用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件中Anova模塊進(jìn)行方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 高效降解AFB1菌株篩選

表2 微生物對(duì)AFB1的降解率

如表2 所示，6 種微生物與AFB1 共同培養(yǎng)24 h后，除短小芽孢桿菌試驗(yàn)組外，其他試驗(yàn)組中AFB1濃度均顯著低于空白對(duì)照組(P＜0.05)。嗜熱鏈球菌對(duì)AFB1的降解率顯著高于其它幾種菌(P＜0.05)。乳酸片球菌對(duì)AFB1的降解率顯著高于短小芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、米曲霉菌、羅伊氏乳桿菌(P＜0.05)。羅伊氏乳桿菌對(duì)AFB1的降解率顯著高于遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和米曲霉菌（P＜0.05）。米曲霉菌對(duì)AFB1的降解顯著高于短小芽孢桿菌和遲緩芽孢桿菌（P＜0.05）。遲緩芽孢桿菌降解率顯著高于短小芽孢桿菌(P＜0.05)。

2.2 嗜熱鏈球菌降解AFB1的產(chǎn)物分析

HPLC-MS檢測(cè)結(jié)果顯示，嗜熱鏈球菌降解AFB1的降解產(chǎn)中含有AFM1，含量為0.011 8 μg/ml，轉(zhuǎn)化率為2.36%。樣品中未發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒醇。

2.3 嗜熱鏈球菌降解霉變飼料中AFB1 的最佳發(fā)酵條件

根據(jù)正交旋轉(zhuǎn)組合編碼表，按照相應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，得出試驗(yàn)結(jié)果如表3。

2.3.1 方差分析

對(duì)表3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，缺失擬合＞0.05，說(shuō)明擬合平方和技術(shù)上是由試驗(yàn)誤差等偶然原因造成的；總模型＜0.01，說(shuō)明回歸方程具有很好的預(yù)測(cè)性能。

2.3.2 T檢驗(yàn)

模型回歸系數(shù)的T 檢驗(yàn)結(jié)果表明，X1、X3、X1X1、X2X1、X3X3、X4X2、X4X4，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P＜0.05)。X3、X1X1、X3X3、X4X4對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響(P＜0.01)。為了保證方程的預(yù)測(cè)更加準(zhǔn)確，保留全部回歸系數(shù)在方程中。

2.3.3 兩因素交互效應(yīng)分析

交互作用的X2X3分析：將因素X1、X4固定在0 水平上，得到交互效應(yīng)方程，用SAS 9.3 rsreg軟件，做交互效應(yīng)X2、X3的三維曲面圖和等高線圖，通過(guò)圖形分析，可了解交互作用X2、X3對(duì)嗜熱鏈球菌對(duì)AFB1的降解效果的影響。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間（X1）和接種量（X4）控制在0 水平時(shí)，水分含量（X2）在（-2、-1、0、1、2）任意水平時(shí)，降解率隨溫度的升高而升高，當(dāng)降解率達(dá)到最大值后隨溫度的升高而下降。發(fā)酵溫度（X3）在（-2、-1、0、1、2）任意水平，降解率隨水分含量的升高而升高，達(dá)到最大值后隨水分含量的升高出現(xiàn)下降。水分和溫度對(duì)降解率的影響較大，水分取中間值水平，溫度取中間值時(shí)降解率較大。

表3 正交旋轉(zhuǎn)組合及試驗(yàn)結(jié)果

交互作用的X1X4分析：同理，當(dāng)水分含量（X2）和溫度（X3）固定在0 水平時(shí)，發(fā)酵時(shí)間（X1）取（-2、-1、0、1、2）任意水平時(shí)，降解率隨接種量的增加而增大，達(dá)到最高值后隨接種量的增大逐漸減小。將接種量（X4）取（-2、-1、0、1、2）任意一水平時(shí)，降解率隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，到達(dá)最高值后隨時(shí)間的增加而下降。當(dāng)水分含量和溫度固定時(shí)，接種量取中間值，發(fā)酵時(shí)間取中間值，降解效果較好。

2.3.4 模型的建立與檢驗(yàn)

利用SAS軟件從嗜熱鏈球菌降解霉變飼料AFB1的降解試驗(yàn)的54個(gè)組中選取降解最佳的5%的組，即降解率高于40.637%的31個(gè)方案。通過(guò)95%的置信區(qū)間預(yù)測(cè)值和自變量頻率，可以確定嗜熱鏈球菌降解AFB1的最佳發(fā)酵條件范圍：發(fā)酵時(shí)間72.86～120 h，水分含量60.06%～65.96%，發(fā)酵溫度43.75～44 ℃，接種量6.072～10.0×108CFU/g，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間120 h，發(fā)酵水分65%，發(fā)酵溫度44 ℃，接種量7×108CFU/g。

2.4 最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證

對(duì)最佳發(fā)酵條件的預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，即發(fā)酵時(shí)間120 h、發(fā)酵水分65%、發(fā)酵溫度44 ℃、接種量7×108CFU/g，結(jié)果如表4。按照預(yù)測(cè)值進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3次重復(fù)試驗(yàn)降解率均值為41.71%，略高于預(yù)測(cè)值，基本符合預(yù)測(cè)值。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論與結(jié)語(yǔ)

近幾年的相關(guān)調(diào)查報(bào)告顯示[6-7]，AFB1 廣泛存在于各種飼料及飼料原料中[8]，存在范圍廣，污染程度高，對(duì)動(dòng)物健康危害風(fēng)險(xiǎn)高[9-10]。隨著相關(guān)生物技術(shù)的應(yīng)用，越來(lái)越多具有降解能力的菌株被發(fā)現(xiàn)[11-14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌對(duì)AFB1的降解能力優(yōu)于其他試驗(yàn)菌株。Shahin[15]從酸奶中分離得一株嗜熱鏈球菌，發(fā)現(xiàn)其對(duì)AFB1的降解率達(dá)96%，本試驗(yàn)中嗜熱鏈球菌對(duì)AFB1 的降解率為80.0%，低于Shahin 的研究結(jié)果，可能與菌株或試驗(yàn)條件有關(guān)。

本試驗(yàn)利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCMS）對(duì)AFB1降解產(chǎn)物黃曲霉毒醇和AFM1進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物中含有微量黃曲霉毒素M1，其毒性較小。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒醇。嗜熱鏈球菌在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和胞外酶[16-17]，這兩種酶能與AFB1發(fā)生酶解反應(yīng)，使AFB1降解為黃曲霉毒素M1。嗜熱鏈球菌還會(huì)產(chǎn)生乳酸和葉酸，能抑制AFB1 產(chǎn)生。相關(guān)研究[18-22]表明嗜熱鏈球菌主要是菌體的吸附作用來(lái)達(dá)到除去AFB1的目的。但這種吸附作用是可逆的，絡(luò)合物的穩(wěn)定性與處理?xiàng)l件和環(huán)境條件有關(guān)，高熱和強(qiáng)酸會(huì)引起結(jié)合可逆性的發(fā)生，但嗜熱鏈球菌的熱穩(wěn)定性較好。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌降解AFB1的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間120 h、發(fā)酵水分65%、發(fā)酵溫度44 ℃、接種量7×108CFU/g。朱新貴等[22]報(bào)道了時(shí)間和溫度對(duì)乳酸菌和枯草芽孢桿菌降解AFB1 的影響，他發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)36 h時(shí)乳酸菌和枯草芽孢桿菌對(duì)AFB1的降解率分別為36%、38%，在60 h 時(shí)降解率達(dá)88%和89%，在66 h時(shí)降解率仍為88%和89%，說(shuō)明在其他條件一定情況下適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間能提高降解率；他還發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在25 ℃時(shí)降解率為74%，30 ℃時(shí)AFB1的降解率為82%，40 ℃時(shí)降解率為78%，由此可見(jiàn)，在一定條件下溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)影響降解率，而且還會(huì)影響微生物酶的活性。很多研究都證明了這一點(diǎn)[23-24]。接種菌量對(duì)降解率也有重要影響，Nezami等[25]對(duì)其研究發(fā)現(xiàn)的幾種能降解AFB1的菌的接種量做出說(shuō)明，他發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中的活菌數(shù)達(dá)到2×109CFU/ml時(shí)，降解效果最好。按照最佳發(fā)酵條件對(duì)自然霉變的飼料進(jìn)行驗(yàn)證，嗜熱鏈球菌對(duì)AFB1 的降解率均值為41.71%，低于我們?cè)诤Y選高效降解菌株時(shí)嗜熱鏈球菌對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)中AFB1的降解率，這可能與飼料粒度、飼料成分復(fù)雜多變有關(guān)。也可能與飼料發(fā)酵過(guò)程中影響到嗜熱鏈球菌的活力有關(guān)，需要進(jìn)一步研究證明。綜上所述，嗜熱鏈球菌可降解飼料中AFB1，可降低AFB1對(duì)動(dòng)物健康危害的風(fēng)險(xiǎn)。