病毒是什么？——人類(lèi)發(fā)現(xiàn)首個(gè)病毒的過(guò)程考察

周 程

“直面新型冠狀病毒肺炎：重大疫情防控的跨學(xué)科研究”專(zhuān)刊

病毒是什么？——人類(lèi)發(fā)現(xiàn)首個(gè)病毒的過(guò)程考察

周 程1，2

（1. 北京大學(xué) 哲學(xué)系，北京 100871；2. 北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)人文學(xué)院，北京 100191）

在細(xì)菌致病學(xué)說(shuō)盛行的時(shí)代，在電子顯微鏡尚未問(wèn)世的情況下，病毒是怎樣被發(fā)現(xiàn)的？病毒的概念又是怎樣被構(gòu)建起來(lái)的？基于科學(xué)思想史視角，對(duì)人類(lèi)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)病毒——煙草花葉病毒過(guò)程中的如下8個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了考察：（1）麥爾發(fā)現(xiàn)煙草患花葉病后其病葉汁液具有傳染性；（2）伊萬(wàn)諾夫斯基發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子具有濾過(guò)性；（3）貝杰林克發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子是“傳染性活流質(zhì)”；（4）呂夫勒和菲洛施發(fā)現(xiàn)?？谔阋咧虏∫蜃邮恰皹O小生物”；（5）伊萬(wàn)諾夫斯基認(rèn)為煙草花葉病致病因子不是活流質(zhì)；（6）杜加爾認(rèn)為煙草花葉病致病因子是可在細(xì)胞內(nèi)增殖的微粒；（7）斯坦利基于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)提出煙草花葉病毒是一種蛋白質(zhì)；（8）煙草花葉病毒原來(lái)是桿狀核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體。在此基礎(chǔ)上，還針對(duì)科學(xué)研究的局限性和科學(xué)認(rèn)知的漸進(jìn)性問(wèn)題進(jìn)行了探討。

細(xì)菌致病學(xué)；煙草花葉病毒；科學(xué)發(fā)現(xiàn)；科學(xué)概念；科學(xué)精神

自武漢爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎以來(lái)，病毒這個(gè)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)在國(guó)內(nèi)迅速普及，可以說(shuō)如今已成為家喻戶(hù)曉、婦孺皆知的日常用語(yǔ)了。不過(guò)，對(duì)于國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)為什么會(huì)在這次的新型冠狀病毒命名問(wèn)題上產(chǎn)生意見(jiàn)分歧，很多人未必有很深刻的理解。

按照美國(guó)主流教科書(shū)《現(xiàn)代病毒學(xué)導(dǎo)論》給出的解釋?zhuān)《臼莵單⒂^的寄生性的含有蛋白質(zhì)衣殼的遺傳物質(zhì)顆粒[1]。說(shuō)得更具體一點(diǎn)，病毒與細(xì)菌不同，是一類(lèi)極小的非細(xì)胞生物；其體積小到可以通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器，人們只能借助電子顯微鏡才能看到它；病毒的結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，通常由蛋白質(zhì)衣殼和核酸內(nèi)芯組成（圖1）。

人類(lèi)最早發(fā)現(xiàn)的病毒是煙草花葉病毒（圖2）（Tobacco Mosaic Virus，縮寫(xiě)為T(mén)MV）。這種亞微觀的病毒究竟是怎樣被發(fā)現(xiàn)的？其概念又是怎樣被構(gòu)建起來(lái)的？不同時(shí)期、不同國(guó)別、不同專(zhuān)業(yè)的學(xué)者在此過(guò)程中扮演了什么樣的角色？

荷蘭林堡大學(xué)健康倫理與哲學(xué)系的赫爾沃特（Ton van Helvoort）博士曾于1991年發(fā)表長(zhǎng)文討論過(guò)這些問(wèn)題[2]，日本東京大學(xué)理學(xué)部名譽(yù)教授岡田吉美甚至在2004年出版專(zhuān)著詳細(xì)梳理了煙草花葉病毒研究百年史[3]。盡管二人的研究已有些年頭，但仍具有重要參考價(jià)值。筆者擬基于他們的研究和新近問(wèn)世的相關(guān)論著，并盡可能對(duì)照當(dāng)年研究煙草花葉病毒的學(xué)者發(fā)表的原始論文或報(bào)告，從科學(xué)思想史視角就上述問(wèn)題做些粗淺的考察，以期能為國(guó)內(nèi)的科學(xué)史和科學(xué)哲學(xué)研究提供一些素材，并為中國(guó)當(dāng)下的科學(xué)技術(shù)治理提供一些借鑒。

圖1 形形色色的病毒

需要指出的是，本文在深描煙草花葉病毒的發(fā)現(xiàn)過(guò)程時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注的是跨時(shí)代、跨國(guó)別和跨專(zhuān)業(yè)的病毒研究人員持續(xù)性的、反思性的“集體學(xué)習(xí)”行動(dòng)。這種研究接力，揭示了有別于傳統(tǒng)的知識(shí)生產(chǎn)模式。其中，每位后來(lái)者扮演的都不是簡(jiǎn)單的“反對(duì)者”角色，而是在揚(yáng)棄的基礎(chǔ)上調(diào)度更多的研究資源，以形成更具魯棒性的科學(xué)共識(shí)。

1 麥爾發(fā)現(xiàn)煙草患花葉病后其病葉汁液具有傳染性

因率先成功制備煙草花葉病毒蛋白質(zhì)結(jié)晶而分享1946年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的美國(guó)生物化學(xué)家斯坦利（Wendell Meredith Stanley，1904-1971），在1944年發(fā)表的一篇文章中指出：有相當(dāng)多的理由將俄國(guó)的植物生理學(xué)家伊萬(wàn)諾夫斯基（Dmitrii Ivanovsky，1864-1920）視作新興的病毒學(xué)學(xué)科之父[4]。盡管如此，討論首個(gè)病毒的發(fā)現(xiàn)經(jīng)緯時(shí)，仍不能不從德國(guó)農(nóng)業(yè)化學(xué)家麥爾（Adolf Eduard Mayer，1843-1942）談起。

麥爾于1843年生于德國(guó)西北部的奧爾登堡。他1860年進(jìn)入卡爾斯魯厄理工學(xué)院學(xué)習(xí)數(shù)學(xué)和化學(xué)，1862年又進(jìn)入著名的海德堡大學(xué)深造，并于1864年獲得該校的博士學(xué)位。在海德堡大學(xué)講授一段時(shí)間的發(fā)酵學(xué)和化學(xué)工程之后[5]13，麥爾于1876年赴荷蘭擔(dān)任瓦格寧根農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站主任[6]。當(dāng)時(shí)，很多種植煙草的農(nóng)民都遇到了一個(gè)困惑，那就是，煙草長(zhǎng)出的深綠色葉子上會(huì)莫名其妙地出現(xiàn)淺綠色斑紋，致使煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量都受到嚴(yán)重的影響（圖3）。為探明該煙草疾病的產(chǎn)生原因，麥爾自1879年開(kāi)始對(duì)煙草的種植展開(kāi)了長(zhǎng)時(shí)間的觀察與實(shí)驗(yàn)研究，并于1882年將這種煙草疾病命名為“煙草花葉病”（mozaik ziekte van de tabak,即Tobacco Mosaic Disease）[3]22（圖4）。

圖3 煙草花葉病癥狀

麥爾曾研究過(guò)種子對(duì)煙草花葉病的影響，但他排除了這一影響的存在。因?yàn)橥慌N子種植在不同的地方，并沒(méi)有都出現(xiàn)花葉病。麥爾還研究過(guò)氣溫、光照對(duì)煙草花葉病的影響，他發(fā)現(xiàn)煙草花葉病與氣候并沒(méi)有直接的關(guān)聯(lián)，因?yàn)椴煌貐^(qū)、不同時(shí)節(jié)的煙草都會(huì)得花葉病。于是，麥爾將研究的重點(diǎn)集中到土壤的影響上。

1840年，德國(guó)的化學(xué)家李比希（Justus von Liebig，1803-1873）公開(kāi)出版了《化學(xué)在農(nóng)業(yè)和生理學(xué)中的應(yīng)用》一書(shū)，揭開(kāi)了近代農(nóng)業(yè)化學(xué)革命的序幕[7]。1862 年，李比希把它增補(bǔ)成兩厚冊(cè)作為第7版出版時(shí)，麥爾正在海德堡大學(xué)攻讀與化學(xué)有關(guān)的學(xué)位。因此，這本名著不可避免地對(duì)他產(chǎn)生了影響。按照李比希在該書(shū)中提出的物質(zhì)補(bǔ)償法則，麥爾推測(cè)，煙草花葉病很有可能是因?yàn)橥寥乐腥鄙倌撤N或某些元素導(dǎo)致煙草營(yíng)養(yǎng)不良造成的。為此，他對(duì)患病煙草和健康煙草的葉子所含有的化學(xué)成分以及患病煙草和健康煙草根莖周?chē)耐寥莱煞诌M(jìn)行了對(duì)比分析，但他并沒(méi)有找到導(dǎo)致煙草患花葉病的原因[8]。

1881年夏季的某一天，麥爾漫無(wú)目的地來(lái)到瓦格寧根農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站的實(shí)驗(yàn)苗圃。他發(fā)現(xiàn)苗圃中種植的好幾個(gè)外國(guó)品種的煙草都沒(méi)有患花葉病，但附近農(nóng)家種植的本國(guó)品種煙草都不同程度地得了花葉病[5]13。麥爾由此意識(shí)到煙草花葉病不太可能是由土壤成分的差異造成的。這些煙田互相毗鄰，土壤成分不可能有太大的差異。既然煙草花葉病不可能是營(yíng)養(yǎng)不良癥，那么它又是由什么因素造成的呢？

當(dāng)時(shí)，德國(guó)細(xì)菌學(xué)家科赫（Robert Koch，1843-1910）雖然尚未因發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌而成為家喻戶(hù)曉的英雄人物，但他1876年在《植物生物學(xué)通訊》上發(fā)表的論文“炭疽熱病因：基于炭疽桿菌的發(fā)展過(guò)程”已在學(xué)術(shù)界產(chǎn)生了廣泛的影響[9]。盡管人們已普遍接受動(dòng)物罹患的一些疾病是因感染了某種特定的細(xì)菌造成的這一細(xì)菌致病理論（germ theory）[10]，但是沒(méi)有任何證據(jù)表明某些植物疾病也是因細(xì)菌感染造成的。

處于窮途末路的麥爾決定模仿科赫的研究看看煙草花葉病是不是也會(huì)通過(guò)病原體傳染。于是，他將患有花葉病的煙草葉子搗碎、將從中提取的汁液用玻璃毛細(xì)管注入多株健康煙草的葉脈中。他發(fā)現(xiàn)，這些煙草已經(jīng)長(zhǎng)出的葉子并沒(méi)有出現(xiàn)花葉病癥，但大約10天后新長(zhǎng)出來(lái)的嫩葉幾乎都出現(xiàn)了花葉病癥。而且，將從患有花葉病的煙草葉子中提取的汁液加熱到攝氏80度后，這些汁液都會(huì)失去上述特性[3]23。因此，麥爾懷疑患病煙草葉子的汁液中含有可傳染花葉病的細(xì)菌。但他使用當(dāng)時(shí)最先進(jìn)的光學(xué)顯微鏡也未觀察到這種假想的細(xì)菌。而且，用培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)后也沒(méi)有培養(yǎng)出任何可傳染煙草花葉病的細(xì)菌。

圖4 麥爾（Adolf Eduard Mayer，1843-1942）拍攝的感染上花葉病的煙草葉子

于是，麥爾開(kāi)始給健康煙草接種各種各樣的已知細(xì)菌，看看導(dǎo)致煙草感染花葉病的細(xì)菌是不是其中的一種。未果后，他又給健康煙草接種一些動(dòng)物和人的糞肥，以及磨碎了的過(guò)期奶酪和腐敗了的豆制品，看看煙草花葉病會(huì)不會(huì)是像酵母那樣的真菌作用的結(jié)果，因?yàn)楫?dāng)時(shí)基于李比希的發(fā)酵和腐敗學(xué)說(shuō)建立起來(lái)的發(fā)酵致病理論（zymotic theory）仍然相當(dāng)流行[11]61-69。當(dāng)然，所有這些努力都未能幫助麥爾找到煙草花葉病的致病因子[8]。

麥爾后來(lái)又做了一系列實(shí)驗(yàn)。他發(fā)現(xiàn)，用單層濾紙過(guò)濾患病煙草葉子的汁液時(shí)，致病因子是能夠通過(guò)濾紙的。但他還發(fā)現(xiàn)，使用雙層濾紙過(guò)濾時(shí)，提取液會(huì)變成“透明濾液”，而且這種濾液不具有傳染性。由此，麥爾推定，煙草感染花葉病不可能是由真菌引起的，因?yàn)榧词故墙湍高@樣的微小真菌也穿越不了濾紙，也就是說(shuō)它們?cè)诘谝淮芜^(guò)濾時(shí)就會(huì)被濾除。麥爾認(rèn)為，煙草花葉病也不會(huì)是酶參與作用的結(jié)果，因?yàn)槊钢?lèi)化學(xué)物質(zhì)不僅不能自我繁殖，而且即使是使用多層濾紙過(guò)濾也不至于被濾除。

麥爾最終給出的結(jié)論是，（1）煙草感染花葉病與細(xì)菌有關(guān)；（2）患有花葉病的煙草葉子污染土壤后容易引起花葉病，因此不能將病變煙葉放置在煙田里。盡管麥爾并沒(méi)有真正找到煙草花葉病的致病因子，但他1886年還是公開(kāi)發(fā)表了上述研究結(jié)論[12]。

實(shí)際上，煙草花葉病是由病毒而非細(xì)菌引起的。由于病毒遠(yuǎn)小于細(xì)菌，使用光學(xué)顯微鏡根本就看不到，所以麥爾當(dāng)時(shí)找不到煙草花葉病的致病因子并不奇怪。問(wèn)題是病毒是可濾過(guò)的，即便使用多層濾紙過(guò)濾，濾液都應(yīng)該具有傳染性。是故，麥爾提出的非濾過(guò)性的細(xì)菌是導(dǎo)致煙草患花葉病的病原這個(gè)觀點(diǎn)并不成立，它經(jīng)受不住重復(fù)實(shí)驗(yàn)的檢驗(yàn)。但毋容置疑的是，麥爾乃史上第一個(gè)發(fā)現(xiàn)煙草花葉病是一種植物傳染病的科學(xué)家。

麥爾開(kāi)啟了煙草花葉病致病因子的研究先河。他的研究結(jié)果對(duì)正在撰寫(xiě)與煙草花葉病有關(guān)的學(xué)位論文的俄國(guó)學(xué)生伊萬(wàn)諾夫斯基以及當(dāng)時(shí)也在瓦格寧根工作的荷蘭同行貝杰林克（Martinus Beijerinck，1851-1931）產(chǎn)生了很大的影響，并為他們?nèi)〉醚芯客黄频於酥匾幕A(chǔ)。

2 伊萬(wàn)諾夫斯基發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子具有濾過(guò)性

伊萬(wàn)諾夫斯基1864年11月9日生于圣彼得堡附近的一個(gè)鄉(xiāng)村，其父乃西伯利亞的一名地主，幼年喪父后，隨家人搬遷至圣彼得堡的一個(gè)貧民區(qū)，并在那里上完了中學(xué)。1888年，伊萬(wàn)諾夫斯基提交的學(xué)位論文“論煙草的兩種疾病”通過(guò)審查，被圣彼得堡大學(xué)授予理學(xué)士學(xué)位。剛畢業(yè)時(shí)，他繼續(xù)待在圣彼得堡大學(xué)，一邊準(zhǔn)備申請(qǐng)教職，一邊在植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作。此后，他轉(zhuǎn)赴圣彼得堡科學(xué)院的法明茨恩（Andrei Sergeevich Famintsyn，1835-1918）實(shí)驗(yàn)室擔(dān)任助手。伊萬(wàn)諾夫斯基于1895年完成論文“對(duì)酒精發(fā)酵的一項(xiàng)調(diào)查”的寫(xiě)作，并因此獲得碩士學(xué)位。之后，他又因在煙草花葉病研究方面卓有建樹(shù)而于1903年被授予博士學(xué)位[13]。同年，伊萬(wàn)諾夫斯基獲聘擔(dān)任波蘭的華沙大學(xué)植物學(xué)系教授。

伊萬(wàn)諾夫斯基在圣彼得堡大學(xué)學(xué)習(xí)期間，曾于1887年和1890年兩度接受俄羅斯農(nóng)業(yè)部的委托赴烏克蘭和克里米亞調(diào)查煙草疾病的形成原因。在搜集有關(guān)煙草疾病的先行研究文獻(xiàn)過(guò)程中，他獲悉德國(guó)學(xué)者麥爾此前已對(duì)煙草花葉病展開(kāi)過(guò)深入細(xì)致的研究[13]。不過(guò)，伊萬(wàn)諾夫斯基在重復(fù)麥爾的實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用兩層濾紙對(duì)患有花葉病的煙草葉子的汁液進(jìn)行過(guò)濾后，所獲得的濾液仍然具有傳染性，這與麥爾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯不符。于是，他又使用一種當(dāng)時(shí)最為先進(jìn)的生產(chǎn)無(wú)菌純凈水用過(guò)濾器——尚柏朗（Charles Chamberland，1851-1908）氏過(guò)濾器對(duì)患有花葉病的煙草葉子的汁液進(jìn)行了過(guò)濾（圖5）。結(jié)果，所獲得的濾液同樣具有傳染性。這使伊萬(wàn)諾夫斯基感到非常納悶[5]14。

圖5 尚柏朗（Charles Chamberland，1851-1908）氏燭形陶瓷濾芯過(guò)濾器

在伊萬(wàn)諾夫斯基看來(lái)，只有兩種可能性可以解釋這種現(xiàn)象。一是這種過(guò)濾器存在質(zhì)量不穩(wěn)定問(wèn)題，以致具有傳染性的細(xì)菌通過(guò)了通常根本無(wú)法通過(guò)的微小濾孔。二是濾液中的致病因子是一種和自己兩年前發(fā)現(xiàn)的毒素類(lèi)似的物質(zhì)，這種毒素有可能是細(xì)菌在加壓過(guò)濾過(guò)程中分泌出來(lái)的。不論是前者還是后者，歸根結(jié)底，汁液的傳染性都是由細(xì)菌導(dǎo)致的。由此可見(jiàn)年輕的伊萬(wàn)諾夫斯基當(dāng)時(shí)對(duì)巴斯德（Louis Pasteur，1822-1895）和科赫的細(xì)菌致病說(shuō)的盲信程度。正因?yàn)槿绱耍茨軐?duì)該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所揭示的意義進(jìn)行深入的思考和探究。他雖然率先發(fā)現(xiàn)通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器的濾液仍然具有傳染性這一現(xiàn)象，但卻未能明確提出濾過(guò)性病原體這一概念[5]14。

其實(shí)，即使是在當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件下，要排除毒素引起花葉病這種可能也并不困難。譬如說(shuō)，可以使用玻璃毛細(xì)管將少量通過(guò)尚柏朗氏過(guò)濾器的汁液稀釋后接種至健康煙草的葉脈中，待該煙草的葉子出現(xiàn)花葉病癥狀后，再提取該患病葉子的汁液，并將其稀釋后接種至其他健康煙草的葉脈中。如果傳染是由毒素類(lèi)化學(xué)物質(zhì)引起的，此時(shí)汁液中的毒素的濃度會(huì)大為降低，因此傳染性會(huì)明顯減弱。這樣重復(fù)做幾輪實(shí)驗(yàn)后，被接種的健康煙草應(yīng)該不會(huì)再出現(xiàn)花葉病癥狀。如果仍然出現(xiàn)，那就意味著汁液中的致病因子具有增殖性，不太可能是毒素類(lèi)化學(xué)物質(zhì)引起的。

當(dāng)然，伊萬(wàn)諾夫斯基也可以多購(gòu)置幾個(gè)過(guò)濾器再做幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。如果更換多個(gè)甚至是多個(gè)型號(hào)的過(guò)濾器后，所獲得的濾液都具有傳染性，那么就應(yīng)該意識(shí)到，即使這種濾過(guò)性病原體是“細(xì)菌”，那它也非通常意義上的細(xì)菌，而是一種體度遠(yuǎn)小于常見(jiàn)細(xì)菌的致病因子。但是，伊萬(wàn)諾夫斯基并沒(méi)有這么做。

伊萬(wàn)諾夫斯基1892年向圣彼得堡科學(xué)院提交了一篇題為“關(guān)于煙草花葉病”的論文，介紹了上述研究發(fā)現(xiàn)[14]。因此，后來(lái)很多學(xué)者，尤其是俄國(guó)學(xué)者據(jù)此認(rèn)為，伊萬(wàn)諾夫斯基是濾過(guò)性病原體、亦即病毒的發(fā)現(xiàn)者。為紀(jì)念伊萬(wàn)諾夫斯基的上述研究業(yè)績(jī)，前蘇聯(lián)《微生物學(xué)》雜志曾在1942年出了一個(gè)紀(jì)念專(zhuān)輯[15]。1964年，在伊萬(wàn)諾夫斯基誕辰100 周年之際，前蘇聯(lián)還將其視作為病毒學(xué)的創(chuàng)始人特意為其發(fā)行了一枚紀(jì)念郵票[16]（圖6）。1992年，普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系的盧斯蒂格（Alice Lustig）和萊文（Arnold J. Levine）在題為《病毒學(xué)100年》的評(píng)論中高度評(píng)價(jià)了伊萬(wàn)諾夫斯基百年前的研究，認(rèn)為該項(xiàng)研究邁出了病毒發(fā)現(xiàn)的第一步[13]。

但是很多歐美學(xué)者認(rèn)為，雖然伊萬(wàn)諾夫斯基1892年發(fā)表的論文值得在病毒學(xué)史中大書(shū)特書(shū)，但將其視作為病毒的發(fā)現(xiàn)者未必合適。例如，1998年，英國(guó)皇家學(xué)會(huì)召開(kāi)了“煙草花葉病毒：一個(gè)世紀(jì)的開(kāi)創(chuàng)性研究”專(zhuān)題研討會(huì)，該會(huì)的組織者就傾向于認(rèn)為荷蘭的微生物學(xué)家貝杰林克才是病毒學(xué)學(xué)科的創(chuàng)始人[6]。

圖6 前蘇聯(lián)發(fā)行的伊萬(wàn)諾夫斯基（D. Ivanovsky, 1864-1920）紀(jì)念郵票

3 貝杰林克發(fā)現(xiàn)煙草花葉病致病因子是“傳染性活流質(zhì)”

貝杰林克1851年生于阿姆斯特丹，1872年畢業(yè)于代爾夫特理工學(xué)院化學(xué)系，1877年獲萊頓大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位。1876年，他赴新創(chuàng)立的瓦格寧根農(nóng)業(yè)學(xué)校擔(dān)任植物學(xué)教師。同年，麥爾也來(lái)到了瓦格寧根。由于研究領(lǐng)域相近，二人在瓦格寧根交往甚密，所以貝杰林克從麥爾那里獲得了不少有關(guān)煙草花葉病的研究信息[17]。1885年，貝杰林克從瓦格寧根搬遷到代爾夫特，在一家生產(chǎn)酵母和酒精的工廠擔(dān)任細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人。1895年，他又來(lái)到代爾夫特理工學(xué)院擔(dān)任細(xì)菌學(xué)教授[16]。

1897年，新的細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室和溫室一經(jīng)建成，貝杰林克便急切地重新開(kāi)啟了煙草花葉病研究。1898年，他發(fā)表了一篇著名論文，提出了“傳染性活流質(zhì)（）”的概念（圖7）。1900年，他又將這篇論文翻譯成了法文，引起了廣泛的關(guān)注[16]。

從貝杰林克1898年發(fā)表的論文中可以看出，他和伊萬(wàn)諾夫斯基一樣使用尚柏朗氏過(guò)濾器對(duì)從患有花葉病的煙草葉子中提取的汁液進(jìn)行了過(guò)濾，并發(fā)現(xiàn)濾液具有傳染性[18]（圖8）。不過(guò)，貝杰林克在上述論文中并沒(méi)有引用伊萬(wàn)諾夫斯基1892年寫(xiě)的論文。這很可能是因?yàn)樗?dāng)時(shí)的確沒(méi)有看到該論文。

尚柏朗氏過(guò)濾器使用無(wú)釉陶瓷做濾芯，濾芯上的濾孔直徑在0.1~1微米，因此即使是非常微小的細(xì)菌也無(wú)法通過(guò)濾芯上的濾孔進(jìn)入濾液?，F(xiàn)在從患有花葉病的煙草葉液中提取的濾液居然有傳染性，如何解釋?zhuān)繂?wèn)題是使用最先進(jìn)的光學(xué)顯微鏡也無(wú)法從濾液中找到致病因子；而且，無(wú)論是在有氧的環(huán)境下，還是在無(wú)氧的環(huán)境下，對(duì)濾液進(jìn)行培養(yǎng)后，都顯示濾液中沒(méi)有任何細(xì)菌。不過(guò)，貝杰林克并沒(méi)有裹足不前。

貝杰林克對(duì)濾液進(jìn)行大劑量稀釋后做了一組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，他發(fā)現(xiàn)大劑量稀釋后的濾液和未經(jīng)稀釋的濾液對(duì)健康煙草產(chǎn)生感染的程度幾乎沒(méi)有差別。而且，受稀釋濾液感染的煙草葉子的汁液仍然具有很強(qiáng)的感染性，健康煙草接種其汁液后仍然都會(huì)出現(xiàn)花葉病癥狀。于是，貝杰林克推定濾液的感染性不是由無(wú)生命的化學(xué)物質(zhì)引起的。

圖7 貝杰林克（M. Beijerinck，1851-1931）1898年論文中的接種實(shí)驗(yàn)插圖

如果濾液中存在有生命的致病因子，那么這種致病因子是如何增殖的呢？貝杰林克又做了一組對(duì)比實(shí)驗(yàn)。他像過(guò)濾患病煙草葉子的汁液一樣，用尚柏朗氏過(guò)濾器對(duì)健康煙草葉子的汁液進(jìn)行了過(guò)濾，并獲得了一批濾液。他將這種濾液加入到有傳染性的濾液中之后，再給健康煙草進(jìn)行接種。他發(fā)現(xiàn)健康煙草感染后的病癥表現(xiàn)程度與他用同體積的蒸餾水稀釋后的帶有傳染性的濾液的情況一樣。這意味著致病因子并沒(méi)有在健康煙草葉子汁液的濾液中發(fā)生增殖。它表明，致病因子只有在有細(xì)胞的條件下才有可能發(fā)生增殖。

盡管濾液中的致病因子無(wú)法用光學(xué)顯微鏡觀察到，但并不能排除它是比細(xì)胞還要小的超顯微顆粒的可能。于是，貝杰林克又使用瓊脂凝膠層析的方法做了一組實(shí)驗(yàn)。他將從患病煙草葉子的汁液中提取的濾液滴到瓊脂凝膠上，然后將其抹勻，并定期加注純凈水，以方便濾液擴(kuò)散。貝杰林克認(rèn)為，如果濾液中的致病因子具有可溶性，那它就會(huì)滲透到瓊脂凝膠內(nèi)部；如果致病因子具有顆粒性，那它就不會(huì)擴(kuò)散。結(jié)果顯示，濾液10日后能夠向瓊脂凝膠內(nèi)部至少擴(kuò)散2毫米。而且，擴(kuò)散至瓊脂凝膠內(nèi)部的濾液仍然具有傳染性。貝杰林克據(jù)此推定，煙草花葉病的致病因子是一種液體或者是可溶的，也就是說(shuō)不是顆粒狀的。

為了弄清煙草花葉病致病因子是如何感染煙草組織的，貝杰林克進(jìn)行了一系列觀察。他發(fā)現(xiàn)，健康煙草接種病變?nèi)~子汁液的濾液后，總是在新長(zhǎng)出來(lái)的嫩葉上出現(xiàn)花葉病斑，已經(jīng)完全成熟的煙草葉子上并不會(huì)出現(xiàn)花葉病斑。葉子在生長(zhǎng)過(guò)程中，總是在葉尖部位出現(xiàn)花葉病斑，在葉尖下部并不會(huì)出現(xiàn)花葉病斑。由于土壤中的致病因子是由根部進(jìn)入煙草體內(nèi)的，因此，貝杰林克推定，致病因子先進(jìn)入煙草莖部，然后再感染正在進(jìn)行細(xì)胞分裂的組織——葉芽或葉尖。致病因子只會(huì)在細(xì)胞組織分裂、生長(zhǎng)時(shí)才增殖，且不會(huì)在不再分裂的成熟的細(xì)胞組織中增殖，但卻可以通過(guò)其傳播擴(kuò)散。

貝杰林克還對(duì)煙草花葉病致病因子的活性進(jìn)行了深入研究。他發(fā)現(xiàn)，濾液保存三個(gè)月之后，其傳染能力并沒(méi)有出現(xiàn)任何變化。而且，在攝氏40度的條件下將在病葉汁液中浸泡過(guò)的濾紙烘干后，仍能使健康煙草出現(xiàn)花葉病癥；將自然干燥后的病葉放置在植物標(biāo)本箱里保存兩年后，同樣能使健康煙草感染花葉病。不過(guò)在這兩種情況下，致病因子的感染能力都會(huì)有所減弱。此外，將病葉汁液的濾液加熱到攝氏90度后，濾液將會(huì)完全失去活性，不再具有傳染性。

圖8 貝杰林克的煙草花葉病實(shí)驗(yàn)記錄

貝杰林克還做了一項(xiàng)有關(guān)煙草花葉病致病因子的越冬性實(shí)驗(yàn)。他在秋季終止給患有花葉病的盆栽煙草澆水，等其枯死后再拔出煙草，并將粘在煙草根部的土放回盆中。第二年春天，他在干放了一個(gè)冬季的盆子里栽了幾顆健康煙草。他發(fā)現(xiàn)，這些健康煙草最終都不同程度地患了花葉病。貝杰林克由此推定，煙草花葉病的致病因子即使在干燥的土壤中也能越冬，而且這些致病因子在春天會(huì)經(jīng)由新栽培的煙草根部、莖部，感染煙草葉子，使其出現(xiàn)花葉病斑。

盡管當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件和對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)有限，但貝杰林克的上述推論和假設(shè)有不少后來(lái)被證明與事實(shí)相當(dāng)吻合。

4 呂夫勒和菲洛施發(fā)現(xiàn)牛口蹄疫致病因子是“極小生物”

值得注意的是，貝杰林克只在論文題目和兩個(gè)小節(jié)的標(biāo)題中使用了“傳染性活流質(zhì)”（）這一術(shù)語(yǔ)，在論文的正文中，貝杰林克提及該因子時(shí)，都用“contagium”（觸染物）或“virus”（病毒）表示，后者更為常見(jiàn)[16]。

根據(jù)《牛津英語(yǔ)詞典》的解釋?zhuān)癡irus”一詞源自于拉丁語(yǔ)，其字面意思是“粘稠的液體，毒素”，在中世紀(jì)晚期的英語(yǔ)中主要指“蛇的毒液”。實(shí)際上，“Virus”的含義在貝杰林克1898年發(fā)表上述文章之前一直沒(méi)有發(fā)生過(guò)太大的變化。因此，在十九世紀(jì)后期，人們?cè)诒磉_(dá)生物體內(nèi)增殖的“poison”（毒素）之意時(shí)，會(huì)根據(jù)自己的喜好選擇“contagion”（觸染物）、“germs（病菌）”、“bacteria”（細(xì)菌）、或“virus”[11]126。它表明，這一時(shí)期“virus”仍未被賦予濾過(guò)性病原體的含義，它和“觸染物”、“病菌”、“細(xì)菌”可以互換使用。

1890年，微生物學(xué)之父巴斯德提出著名的論斷：“tout virus est un microbe”（所有的病毒都是微生物）。[16]但是，時(shí)過(guò)八年之后，貝杰林克就將“virus”用來(lái)指代“傳染性活流質(zhì)”。貝杰林克的“傳染性活流質(zhì)”的概念包含這幾層含義：（1）能通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器；（2）具有傳染性；（3）能在生物體內(nèi)增殖，但不能在體外生長(zhǎng)。簡(jiǎn)言之，病毒是一種濾過(guò)性病原體。

很明顯，貝杰林克1898年時(shí)已經(jīng)確立了存在一種自主的亞微觀（亞細(xì)胞）生命形式的信念。于是，“所有的病毒都是微生物”變成了“病毒不是微生物”。貝杰林克對(duì)病毒概念如此進(jìn)行形塑與德國(guó)的細(xì)菌學(xué)家、科赫的弟子呂夫勒（Friedrich Loeffler，1852-1915）和菲洛施（Paul Frosch，1860-1928）的工作有著一定的關(guān)聯(lián)。

1882年，科赫在柏林生理學(xué)學(xué)會(huì)上宣布，他找到了結(jié)核病的病原體，這是一種若不用特殊染料進(jìn)行染色，用光學(xué)顯微鏡根本看不見(jiàn)；而且生長(zhǎng)十分緩慢，即使在特殊培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后也只能形成很小菌落的新型桿菌[9]?？坪盏倪@一重大發(fā)現(xiàn)在學(xué)界掀起了一波尋找疑難病病原菌的熱潮[10]?？坪盏闹謪畏蚶胀昃桶l(fā)現(xiàn)了類(lèi)鼻疽桿菌，1884年又培養(yǎng)出了白喉?xiàng)U菌[19]。積累了豐富的細(xì)菌學(xué)研究經(jīng)驗(yàn)后，呂夫勒又和菲洛施合作于1897年在科赫擔(dān)任所長(zhǎng)的普魯士皇家傳染病研究所（現(xiàn)羅伯特·科赫研究所，RKI）啟動(dòng)了?？谔阋卟≡w的探究（圖9）。如前所述，貝杰林克也是在同年啟動(dòng)了對(duì)煙草花葉病的研究。

?？谔阋呤且环N傳染病，其典型癥狀是?？谇弧⑷榉亢吞悴砍霈F(xiàn)水泡和潰爛，犢牛患病后死亡率相當(dāng)高（圖10）。呂夫勒和菲洛施研究后發(fā)現(xiàn)，牛患口蹄疫后，其淋巴液中含有能通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器的傳染性物質(zhì)，而且這種口蹄疫致病因子小到無(wú)法通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到，也無(wú)法在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。還有，病牛淋巴液的濾液經(jīng)過(guò)高度稀釋后，仍然具有傳染性，因此可排除其為化學(xué)毒素的可能性[20]。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)和伊萬(wàn)諾夫斯基1892年研究煙草花葉病時(shí)的發(fā)現(xiàn)有著很多相似之處，不同的是，后者當(dāng)時(shí)沒(méi)有用實(shí)驗(yàn)排除致病因子是化學(xué)毒素的可能。

呂夫勒曾長(zhǎng)期在科赫身邊工作，他對(duì)科赫確立的細(xì)菌致病理論深信不疑。因此，盡管?？谔阋叩牟≡w具有濾過(guò)性，但他仍然不愿意全面修正細(xì)菌致病理論。呂夫勒和菲洛施認(rèn)為，?？谔阋卟≡w雖然能夠通過(guò)連最小的細(xì)菌都無(wú)法通過(guò)的過(guò)濾器濾孔，但它仍是一種微粒（corpuscular）。人類(lèi)和動(dòng)物罹患的很多其他傳染病，例如天花、牛痘、猩紅熱、麻疹、傷寒和牛瘟等，其病原體也都是這種類(lèi)型的“極小生物體”（）。很明顯，在呂夫勒和菲洛施看來(lái)，究極而言牛口蹄疫病原體是一種微生物，只不過(guò)其體度極小罷了。

圖9 呂夫勒（Friedrich Loeffler，1852-1915）1897年所在的皇家傳染病研究所

呂夫勒和菲洛施將上述研究成果整理成了4份研究報(bào)告，第1份報(bào)告的落款日期為1897年4月17日，因此被認(rèn)為有可能在當(dāng)年就已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表了。不過(guò)，可以確定的是呂夫勒和菲洛施于1897年9月發(fā)表了一份德文的研究摘要，可能是因?yàn)闆](méi)有過(guò)濾實(shí)驗(yàn)記錄，所以沒(méi)有引起貝杰林克的關(guān)注。貝杰林克在1898年的論文中只提到了呂夫勒1898年獨(dú)立發(fā)表的第4份研究報(bào)告[16]。毋容置疑，貝杰林克在研究煙草花葉病過(guò)程中受到了呂夫勒對(duì)?？谔阋卟≡w的研究影響。但是，二人在濾過(guò)性病原體究竟是微粒還是流質(zhì)一事上看法截然不同。因此，貝杰林克在1898年的論文中批評(píng)了呂夫勒的濾過(guò)性病原體微粒說(shuō)。

要而言之，貝杰林克發(fā)現(xiàn)煙草花葉病病原體的時(shí)間點(diǎn)與呂夫勒和菲洛施發(fā)現(xiàn)?？谔阋卟≡w的時(shí)間點(diǎn)幾乎沒(méi)有差異，而且他們都用實(shí)驗(yàn)表明濾過(guò)性病原體是一種客觀存在。只是雙方對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋不同，貝杰林克認(rèn)為這種新病原體是“傳染性活流質(zhì)”，不是細(xì)菌；呂夫勒和菲洛施認(rèn)為這種新病原體乃迄今為止從未遇到過(guò)的一種極其細(xì)小的微粒，但它仍屬于微生物，除體度外和細(xì)菌沒(méi)有太大的差異。因此，將貝杰林克視作病毒概念的提出者似乎更有說(shuō)服力。但是，若將濾過(guò)性病原體的發(fā)現(xiàn)等同于病毒的發(fā)現(xiàn)，那么將病毒發(fā)現(xiàn)者的榮冠戴在貝杰林克的頭上還不如戴在呂夫勒和菲洛施的頭上更合適。實(shí)際上，伊萬(wàn)諾夫斯基早在1892年就已發(fā)現(xiàn)了濾過(guò)性病原體，只是他對(duì)當(dāng)時(shí)觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象沒(méi)有進(jìn)行深究罷了。

圖10 現(xiàn)已解明的口蹄疫病毒生命周期示意圖

5 伊萬(wàn)諾夫斯基認(rèn)為煙草花葉病致病因子不是活流質(zhì)

1899年，貝杰林克將自己1898年發(fā)表的上述論文翻譯成了德文。這篇德文論文很快就引起了伊萬(wàn)諾夫斯基的關(guān)注。伊萬(wàn)諾夫斯基當(dāng)年就寫(xiě)了一篇論文回應(yīng)道：自己早在1892年就已發(fā)現(xiàn)濾過(guò)性病原體，因此濾過(guò)性病原體的發(fā)現(xiàn)者應(yīng)該是他，而不是別人[3]23。通過(guò)貝杰林克的論文，伊萬(wàn)諾夫斯基獲悉貝杰林克和呂夫勒對(duì)濾過(guò)性病原體是微粒還是流質(zhì)存在嚴(yán)重的意見(jiàn)分歧。伊萬(wàn)諾夫斯基難以接受貝杰林克的活流質(zhì)說(shuō)，他更傾向于支持呂夫勒的微粒說(shuō)。于是，伊萬(wàn)諾夫斯基開(kāi)始對(duì)貝杰林克基于實(shí)驗(yàn)提出的諸多觀點(diǎn)進(jìn)行了追試[5]16-17。

伊萬(wàn)諾夫斯基也使用尚柏朗氏過(guò)濾器對(duì)患花葉病的煙草葉子的汁液進(jìn)行了過(guò)濾（圖11）。不過(guò)，伊萬(wàn)諾夫斯基過(guò)濾時(shí)沒(méi)有給汁液加壓，而且分三個(gè)時(shí)段進(jìn)行了采樣。他發(fā)現(xiàn)，健康煙草接種這些濾液試樣后發(fā)病情況存在明顯差異。具體而言，最初采集的濾液確實(shí)具有傳染性，會(huì)使健康煙草出現(xiàn)花葉病癥。但是，過(guò)濾12小時(shí)后采集的濾液試樣和過(guò)濾36小時(shí)后采集的濾液試樣都不具有傳染性。因此，他認(rèn)為貝杰林克的活流質(zhì)說(shuō)不成立。

圖11 燭形陶瓷濾芯過(guò)濾原理示意圖

在伊萬(wàn)諾夫斯基看來(lái)，如果煙草花葉病病原體是液體，或者是可溶的，那么不論是在哪個(gè)時(shí)段采集的濾液都應(yīng)具有傳染性，只有當(dāng)煙草花葉病病原體是微粒時(shí)才會(huì)出現(xiàn)濾液的傳染性隨時(shí)間不斷降低的情況。其原因是，在不加壓的情況下，微粒形態(tài)的病原體會(huì)逐漸淤積在過(guò)濾器的微小濾孔中，使得病原體越來(lái)越難以通過(guò)濾孔，當(dāng)達(dá)到一定的時(shí)間值后，只有液體才能通過(guò)過(guò)濾器的濾孔，由于此時(shí)微粒形態(tài)的病原體也不再能夠通過(guò)濾孔，所以濾液不再具有傳染性。

伊萬(wàn)諾夫斯基對(duì)貝杰林克的瓊脂凝膠層析實(shí)驗(yàn)也進(jìn)行了追試。不過(guò)，伊萬(wàn)諾夫斯基使用的是剛剛凝固成形的新鮮瓊脂凝膠。他發(fā)現(xiàn)，患有花葉病的煙草葉汁的濾液根本就不會(huì)在這種新鮮瓊脂凝膠中擴(kuò)散，而且做對(duì)比實(shí)驗(yàn)用的顏料墨水溶液也不會(huì)在這種新鮮瓊脂凝膠中擴(kuò)散。但是，如果使用放置數(shù)日的陳舊瓊脂凝膠做實(shí)驗(yàn)，那么煙草葉汁的濾液和顏料墨水溶液都會(huì)在瓊脂凝膠中擴(kuò)散。

圖12 伊萬(wàn)諾夫斯基1903年論文中的病葉光學(xué)顯微鏡觀察圖

伊萬(wàn)諾夫斯基的解釋是，瓊脂凝膠放置一段時(shí)間后內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)細(xì)微裂紋，從而使煙草葉汁的濾液和顏料墨水溶液能夠滲透到其內(nèi)部。顏料墨水溶液能夠在陳舊瓊脂凝膠中擴(kuò)散，說(shuō)明陳舊瓊脂凝膠中的裂紋已經(jīng)相當(dāng)之大。因此，貝杰林克觀察到的煙草葉汁的濾液在瓊脂凝膠中擴(kuò)散的現(xiàn)象不足以證明煙草花葉病的濾過(guò)性病原體是流質(zhì)的觀點(diǎn)。

既然煙草花葉病的病原體不是液體或可溶的，那它是什么？是一種細(xì)菌，還是一種異常原生質(zhì)? 伊萬(wàn)諾夫斯基認(rèn)為，它應(yīng)該是一種極其微小的細(xì)菌。

只要煙草花葉病的病原體是細(xì)菌，不論它的體度小到何種程度，都應(yīng)該能夠進(jìn)行體外培養(yǎng)。因此，伊萬(wàn)諾夫斯基嘗試著對(duì)煙草花葉病的病原體進(jìn)行了體外培養(yǎng)。他發(fā)現(xiàn)，健康煙草接種培養(yǎng)液后出現(xiàn)花葉病的個(gè)體數(shù)量比對(duì)比組的要多，這個(gè)現(xiàn)象似乎只能用病原體在體外培養(yǎng)時(shí)發(fā)生了增殖來(lái)進(jìn)行解釋。因此，伊萬(wàn)諾夫斯基最終還是傾向于認(rèn)定，煙草花葉病病原體是一種極其特殊的細(xì)菌（microbe），而非人們通常所講的細(xì)菌。不過(guò)，他在1903年公開(kāi)發(fā)表的論文的結(jié)尾處提到，有關(guān)煙草花葉病病原體的人工培養(yǎng)問(wèn)題需留待將來(lái)繼續(xù)研究（圖12）。

伊萬(wàn)諾夫斯基對(duì)貝杰林克的流質(zhì)說(shuō)進(jìn)行了有力的反駁，但他并沒(méi)有用實(shí)驗(yàn)充分證明煙草花葉病病原體就是微粒。因此，進(jìn)入20世紀(jì)后，學(xué)術(shù)界圍繞濾過(guò)性病原體，亦即貝杰林克所說(shuō)的病毒是否是微粒問(wèn)題展開(kāi)了新一輪的研究競(jìng)爭(zhēng)。

6 杜加爾認(rèn)為煙草花葉病致病因子是可在細(xì)胞內(nèi)增殖的微粒

邁入20世紀(jì)后，躋身煙草花葉病毒研究領(lǐng)域的學(xué)者越來(lái)越多。因電子顯微鏡的普及是1939年以后的事，故20世紀(jì)初期人們對(duì)煙草花葉病毒的研究只能是各顯神通。當(dāng)時(shí)，人們討論得最多的問(wèn)題是，煙草花葉病毒究竟是不是微粒？它是不是微生物？

1899年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部植物產(chǎn)業(yè)局專(zhuān)家伍茲(Albert F. Woods，1866-1948) 在研究葉綠素變色問(wèn)題時(shí)意識(shí)到樹(shù)葉入秋后由綠變黃可能是葉內(nèi)的氧化酶的作用結(jié)果。他由此推測(cè)某些植物病變，譬如煙草花葉病有可能是因葉內(nèi)的氧化酶或過(guò)氧化酶活性增強(qiáng)所致[2]。這意味著煙草花葉病有可能不是外源性疾病，而是植物本身出了問(wèn)題。1902年，他深入研究后發(fā)現(xiàn)患花葉病的煙草葉子的汁液中的確含有大量的氧化酶。他據(jù)此斷定，煙草花葉病是因氧化酶的新陳代謝發(fā)生紊亂引起的[21]。這樣，毒素說(shuō)又開(kāi)始抬頭。稍后進(jìn)入美國(guó)農(nóng)業(yè)部植物產(chǎn)業(yè)局擔(dān)任專(zhuān)家的奧拉德（Harry A. Allard，1880-1963）對(duì)毒素說(shuō)表示懷疑。他1916年在對(duì)伍茲的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行追試后指出，氧化酶不是引發(fā)煙草患花葉病的原因，而是煙草患花葉病導(dǎo)致的結(jié)果[22]。

當(dāng)時(shí)第一次世界大戰(zhàn)正酣，奧拉德無(wú)法從德、法等國(guó)買(mǎi)到尚柏朗氏過(guò)濾器。正巧利文斯通（Burton. E. Livingstone）1908年發(fā)明了一種用于監(jiān)測(cè)土壤水分變化情況的裝置（圖13）。該裝置帶有一個(gè)埋在土壤中的、主要用云母制成的多孔杯。于是，奧拉德就用這種現(xiàn)成的多孔杯來(lái)替代尚柏朗氏過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。他發(fā)現(xiàn)，患花葉病的煙草葉子的汁液用這種多孔杯過(guò)濾后，濾液中確實(shí)含有高活性的氧化酶，但這種濾液幾乎沒(méi)有傳染性。它表明煙草花葉病病原體已被多孔杯過(guò)濾掉了。盡管這是一項(xiàng)偶然發(fā)現(xiàn)，但它卻很好地證明了氧化酶并非煙草花葉病的病原體，同時(shí)還證明了煙草花葉病病原體是可被云母吸附的顆粒。

奧拉德還發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病病原體不僅能夠被云母吸附，而且使用高濃度的乙醇對(duì)其進(jìn)行處理后病原體還會(huì)失去活性。不過(guò)，使用45%～50%的乙醇對(duì)其進(jìn)行處理后，病原體仍然會(huì)保持較強(qiáng)的活性，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)沉淀。

圖13 利文斯通（B. E. Livingstone）1908年發(fā)明的帶有多孔杯的土壤水分監(jiān)測(cè)儀

奧拉德的上述研究引起了美國(guó)著名的植物生理學(xué)家、植物病理學(xué)拓荒者杜加爾（Benjamin M. Duggar，1872-1956）的注意。杜加爾1898年在康奈爾大學(xué)取得博士學(xué)位后，曾赴美國(guó)農(nóng)業(yè)部擔(dān)任過(guò)一年的植物生理學(xué)專(zhuān)家。1912年，他來(lái)到圣路易斯擔(dān)任華盛頓大學(xué)的植物生理學(xué)教授和密蘇里植物園的生理學(xué)專(zhuān)家，開(kāi)始涉足煙草花葉病研究[23]。

杜加爾和其研究助理使用奧拉德的方法制得煙草花葉病病原體的沉淀物后，通過(guò)與已知物質(zhì)顆粒的大小進(jìn)行比對(duì)，于1921年推定，煙草花葉病致病因子的大小與血紅蛋白相近，直徑大約為30納米，體積大約是一般細(xì)菌的1/37000[24]。當(dāng)時(shí)，測(cè)定血紅蛋白、明膠這類(lèi)膠體的分子大小時(shí)都是先讓它們?cè)谌芤褐谐浞謹(jǐn)U散，然后用孔徑不同的超細(xì)過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，根據(jù)其不能通過(guò)的最大孔徑來(lái)推定該分子的大小取值范圍。

杜加爾在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，用45%~50%的乙醇處理后獲得的煙草花葉病致病因子好幾天后仍具有傳染性。此前，有研究表明，枯草菌的芽孢對(duì)高濃度的乙醇也具有耐受性。兩者的性質(zhì)似乎沒(méi)有本質(zhì)上的差異。杜加爾感到很好奇，于是和其研究助理對(duì)煙草花葉病致病因子和枯草菌的芽孢展開(kāi)了比較研究。結(jié)果，枯草菌的芽孢在瑪瑙研缽中研磨3小時(shí)后就失去活性，而煙草花葉病致病因子研磨9個(gè)小時(shí)后仍然具有一定的傳染性[25]（圖14）。杜加爾給出的解釋是，枯草菌的芽孢在研磨過(guò)程中由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞了所以才失去活性，煙草花葉病致病因子的體積只有枯草菌芽孢的1/37000，由于不可能擁有枯草菌芽孢那樣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以長(zhǎng)時(shí)間研磨后仍未失去傳染性。這意味著煙草花葉病致病因子乃有別于細(xì)菌的微粒。

圖14 電動(dòng)瑪瑙研缽主要部件

杜加爾在1923年的上述論文中指出：目前，認(rèn)為煙草花葉病致病因子是細(xì)菌的觀點(diǎn)可能是完全錯(cuò)誤的；被廣泛接受的觀點(diǎn)是煙草花葉病致病因子乃“病毒”。這種病毒在細(xì)胞內(nèi)具有非同尋常的活性，但脫離細(xì)胞后，和任何沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膠體粒子一樣沒(méi)有活性。總體看來(lái)，花葉病毒的行為更像是生物膠體，但它具有復(fù)制力。在該文的末尾，他寫(xiě)道：“花葉病的致病因子可能是宿主細(xì)胞的間歇性產(chǎn)物，但不是像酶那樣簡(jiǎn)單的產(chǎn)物，更像是構(gòu)成染色質(zhì)的顆?；蚓哂心撤N遺傳結(jié)構(gòu)，譬如基因那樣的顆粒。也就是說(shuō)，它擺脫了宿主細(xì)胞中各種調(diào)節(jié)機(jī)制的束縛，并被賦予了自我復(fù)制的能力。”[25]至于顆粒狀的煙草花葉病致病因子自身究竟有沒(méi)有生命？杜加爾并沒(méi)有回答。

由上可知，一戰(zhàn)結(jié)束之初，美國(guó)的煙草花葉病毒研究水準(zhǔn)就已超過(guò)歐洲。此時(shí)，在一些美國(guó)學(xué)者看來(lái)，致使煙草患花葉病的病毒乃濾過(guò)性病原體，但它既不是“傳染性活流質(zhì)”，也不像具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的“極小生物”，而是可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的超顯微顆粒。問(wèn)題是這種顆粒狀的病毒究竟是什么？

7 斯坦利基于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)提出煙草花葉病毒是一種蛋白質(zhì)

19世紀(jì)末期的煙草花葉病毒研究雖然只是小荷才露尖尖角，但卻帶動(dòng)了20世紀(jì)早期的病毒研究的快速發(fā)展。不過(guò)，“20世紀(jì)早期的病毒研究主要在病毒病，而不在病毒的本質(zhì)，因?yàn)樽R(shí)別某些傳染病比識(shí)別病原體要容易些?！盵26]

一戰(zhàn)后初期，在煙草花葉病毒研究領(lǐng)域表現(xiàn)最為突出的研究團(tuán)隊(duì)當(dāng)屬博伊斯湯普森植物研究所的昆克爾實(shí)驗(yàn)室。昆克爾（Louis O. Kunkel，1884-1960）早年曾在美國(guó)農(nóng)業(yè)部植物產(chǎn)業(yè)局研究過(guò)土豆病毒病，1920年去夏威夷工作后主要研究甘蔗病毒病，1923年他接受新成立的湯普森植物研究所的聘請(qǐng)來(lái)到紐約，負(fù)責(zé)組建植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室[27]。該實(shí)驗(yàn)室很快就吸引來(lái)了一批對(duì)煙草花葉病毒研究抱有濃厚興趣的學(xué)者。其中的代表人物有普爾蒂（H.A.Purdy）、霍姆斯（F.O.Holmes）和文森（C.G.Vinson）[3]41-46。

普爾蒂在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，患有花葉病的煙草葉汁中存在一種健康煙草葉汁中沒(méi)有的特殊物質(zhì)，而且用煙草花葉病毒感染同為茄科的番茄、矮牽牛、辣椒等植物后，其葉汁中同樣含有這種物質(zhì)，但在受其他病毒感染的煙草葉汁中并沒(méi)有找到這種物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明，將該特殊物質(zhì)與使用兔子制備的抗煙草花葉病毒血清混合后，其感染性會(huì)被中和。很明顯，這種具有抗原性的特殊物質(zhì)源自于煙草花葉病毒。由于已有研究表明，具有抗原性的物質(zhì)通常都是蛋白質(zhì)，所以普爾蒂在1928年推定煙草花葉病毒中含有蛋白質(zhì)。

霍姆斯在閱讀與煙草花葉病有關(guān)的研究文獻(xiàn)時(shí)注意到，有多篇文章提及將患有花葉病的煙草葉汁接種到某些煙草屬植物的葉子上之后，該片葉子上會(huì)出現(xiàn)局部病斑。于是，他給17種煙草屬植物接種了患有花葉病的煙草葉汁，結(jié)果，其中5種植物的葉子上出現(xiàn)了局部病斑（圖15）?；裟匪勾_認(rèn)這些局部病斑都是由煙草花葉病毒感染引起的。他認(rèn)為可以用受感染葉子上的局部病斑數(shù)量來(lái)檢測(cè)所接種的煙草花葉病毒的濃度。于是，他于1929年開(kāi)發(fā)出了使用心葉煙草定量檢測(cè)煙草花葉病毒濃度的新方法。這種方法不僅耗時(shí)短、精度高，而且簡(jiǎn)單易行。此項(xiàng)研究為煙草花葉病毒的提純帶來(lái)了極大的便利。

文森在處理被煙草花葉病毒感染的煙草病葉提取液時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加藏紅、丙酮、乙醇等沉淀劑后，傳染性物質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀。而且，添加藏紅后沉淀的那些被認(rèn)為是病毒的傳染性物質(zhì)，不再具有傳染性，但去除其中的藏紅后，又會(huì)恢復(fù)傳染性。文森認(rèn)為這可能是傳染性物質(zhì)與藏紅發(fā)生反應(yīng)造成的，換言之，病毒可能是一種化學(xué)物質(zhì)。他于1931年推定這種化學(xué)物質(zhì)與酶類(lèi)似。此外，文森還注意到，用丙酮處理煙草病葉提取液時(shí)，會(huì)有結(jié)晶析出。不過(guò)，這種結(jié)晶的傳染性不強(qiáng)，而且含有不少雜質(zhì)。盡管他試圖用結(jié)晶的方式提取分離煙草花葉病毒，但一直沒(méi)有成功。

圖15 煙草花葉病毒誘發(fā)的煙葉局部病斑

從煙草病葉的提取液中成功分離出煙草花葉病毒晶體的是美國(guó)洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所的生物化學(xué)家斯坦利。

1932年，在時(shí)任所長(zhǎng)西蒙·弗萊克斯納（Simon Flexner，1863-1946）的主導(dǎo)下，洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所將位于普林斯頓的動(dòng)物病理學(xué)部擴(kuò)充為動(dòng)物與植物病理學(xué)部。鑒于昆克爾在湯普森植物研究所組織開(kāi)展植物病理學(xué)研究卓有成效，弗萊克斯納決定聘請(qǐng)他擔(dān)任新設(shè)立的植物病理學(xué)部門(mén)主任。昆克爾到任后，除了將霍姆斯等一批老部下帶到新單位之外，還將剛滿(mǎn)28歲的斯坦利納入自己的麾下。

斯坦利曾在伊利諾伊大學(xué)跟隨在美國(guó)科學(xué)界和工業(yè)界享有盛譽(yù)的著名化學(xué)家羅杰·亞當(dāng)斯（Roger Adams，1889-1971）教授學(xué)習(xí)有機(jī)化學(xué)，并于1929年在那里獲得博士學(xué)位。之后，他又赴德國(guó)慕尼黑跟隨1927年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主海因里希·維蘭德（Heinrich Wieland，1877-1957）教授做了一段時(shí)間與天然物化學(xué)有關(guān)的博士后研究。[28]在這兩個(gè)有機(jī)化學(xué)頂尖研究室受到的學(xué)術(shù)訓(xùn)練為他進(jìn)入科研經(jīng)費(fèi)充裕的洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所開(kāi)展煙草花葉病毒結(jié)晶研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

斯坦利1933年啟動(dòng)煙草花葉病毒結(jié)晶研究可以說(shuō)是恰逢其時(shí)。（1）已有研究表明，煙草花葉病毒可能含有蛋白質(zhì)；（2）提純所需的快速測(cè)定煙草花葉病毒濃度的方法已經(jīng)確立；（3）從溶液中制備高純度晶體蛋白酶已有成功先例。關(guān)于第（3）點(diǎn)，需要再做些補(bǔ)充說(shuō)明。

1926年康奈爾大學(xué)生物化學(xué)助理教授薩姆納（James B. Sumner，1887-1955）成功地從刀豆中提取分離出晶體脲酶,這是生物化學(xué)史上首次獲得的晶體酶。受其鼓舞，洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所研究員諾斯羅普（John H. Northrop，1891-1987）重啟了胃蛋白酶的研究與制備工作，并于1930年從一種商業(yè)胃蛋白酶制劑中分離出了晶體胃蛋白酶。此后，他又與人合作分離出了多種蛋白酶及其前體，從而使“酶是蛋白質(zhì)”這一發(fā)現(xiàn)成為學(xué)界共識(shí)，并且積累了豐富的制備晶體蛋白酶的經(jīng)驗(yàn)[29]。

斯坦利的煙草花葉病毒結(jié)晶研究是從重復(fù)文森等人的實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的。由于煙草病葉的提取液中除含有煙草花葉病毒外，還含有很多其他成分，所以需要采用鹽析法和層析法進(jìn)行提純。關(guān)鍵是使用鹽析法進(jìn)行分級(jí)沉淀時(shí)，需要對(duì)變量進(jìn)行嚴(yán)格控制。斯坦利是學(xué)有機(jī)化學(xué)出身的，而且必要時(shí)還可以請(qǐng)所里的同事諾斯羅普提供幫助。這些有利條件都是文森所不具備的。而且，在濃縮病毒過(guò)程中，還需要頻繁地使用局部斑紋定量檢測(cè)法來(lái)確認(rèn)沉淀物或上清液有無(wú)傳染性。由于霍姆斯已成為同事，所以必要時(shí)也可以隨時(shí)請(qǐng)教。總之，斯坦利很快就獲得了高濃度的煙草花葉病毒提取物。

斯坦利發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶雖然能抑制這種煙草花葉病毒提取物的傳染性，但其傳染性仍能恢復(fù)，而胃蛋白酶則能使其水解，從而徹底失去傳染性。據(jù)此，他1934年得出結(jié)論：煙草花葉病毒是一種蛋白質(zhì)，或與某種蛋白質(zhì)密切相關(guān)。其后，對(duì)煙草花葉病毒在不同氫離子濃度下的滅活速率的研究也同樣支撐這一結(jié)論[30]。這一結(jié)論無(wú)疑有助于斯坦利將目標(biāo)直接鎖定蛋白質(zhì)結(jié)晶的制備來(lái)設(shè)計(jì)接下來(lái)的濃縮與純化煙草花葉病毒的研究進(jìn)路。

由于方向明確、路線正確、條件優(yōu)越，斯坦利1935年就從煙草病葉的提取液中成功地濃縮、分離出了高純度的煙草花葉病毒結(jié)晶（圖16）。該結(jié)晶即使稀釋10億倍或重復(fù)結(jié)晶10次仍然具有傳染性。而且，給動(dòng)物注射這種結(jié)晶后獲得的抗血清能夠抑制煙草花葉病毒的傳染性。斯坦利隨即就將這項(xiàng)研究結(jié)論發(fā)表在當(dāng)年的《科學(xué)》雜志上。他在這篇文章中明確指出：“煙草花葉病毒被認(rèn)為是一種自催化蛋白質(zhì)，就目前而言，它的增殖可能需要活細(xì)胞的存在。”“該蛋白質(zhì)的分子量，大約是幾百萬(wàn)。”[31]

圖16 斯坦利（W. M. Stanley，1904-1971）1935年制備的TMV結(jié)晶

在西門(mén)子公司于1939年首次推出實(shí)用電子顯微鏡之前，科學(xué)家們雖然有足夠的證據(jù)斷定煙草花葉病毒是一種不同于細(xì)菌的微粒，但一直無(wú)法借助光學(xué)顯微鏡觀察到病毒。在根本看不到病毒的情況下，要將病毒分離出來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而對(duì)其本質(zhì)展開(kāi)深入探究，無(wú)異于緣木求魚(yú)。斯坦利獨(dú)辟蹊徑，采用化學(xué)方法從患有花葉病的煙草葉子的提取液中成功分離出煙草花葉病毒結(jié)晶，使煙草花葉病毒變成一種既“看得見(jiàn)”又“摸得著”的蛋白質(zhì)顆粒。這一貢獻(xiàn)無(wú)疑推動(dòng)了人們從分子水平去進(jìn)一步認(rèn)識(shí)病毒的本質(zhì)，促進(jìn)了生物學(xué)與化學(xué)以及生物學(xué)與物理學(xué)的交叉融合，并為分子生物學(xué)的誕生奠定了重要基礎(chǔ)。斯坦利因在病毒蛋白質(zhì)的分離、純化與結(jié)晶方面貢獻(xiàn)突出，1946年與薩姆納、諾斯羅普一道被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這是病毒研究領(lǐng)域的第一個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)。

8 煙草花葉病毒原來(lái)是桿狀核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體

斯坦利從患有花葉病的煙草葉子的提取液中濃縮、分離出蛋白質(zhì)結(jié)晶，并用實(shí)驗(yàn)證明這種蛋白質(zhì)結(jié)晶具有傳染性，亦即能夠進(jìn)行自我增殖。自我增殖乃生物才具有的屬性，如果像蛋白質(zhì)這樣的化學(xué)物質(zhì)的確具有自我增殖能力，那么生命和物質(zhì)之間的界限豈不需要重新劃分？面對(duì)年輕的化學(xué)家提出的挑戰(zhàn)，生物學(xué)家不可能無(wú)動(dòng)于衷。那些堅(jiān)信病毒是生物，晶體蛋白質(zhì)不是生物，因而不可能是病毒的生物學(xué)家最初的反應(yīng)是對(duì)斯坦利的研究結(jié)論表示懷疑[2]。

理論上講，病原體的確定必須遵循生物學(xué)家公認(rèn)的“科赫四原則”[32]。具體到煙草花葉病毒就是以下情況。（1）所有煙草病葉中都應(yīng)含有煙草花葉病毒，但健康的煙草葉子中不能有。在這種情況下，我們并不知道煙草花葉病毒是導(dǎo)致煙草葉子受感染的原因，還是煙草葉子受感染后出現(xiàn)的結(jié)果。（2）從煙草病葉中分離出煙草花葉病毒，并進(jìn)行純培養(yǎng)或純化處理。如果不能獲得無(wú)雜質(zhì)的純粹煙草花葉病毒，根本就無(wú)法做單一要素可控實(shí)驗(yàn)。而非單一要素實(shí)驗(yàn)，對(duì)其結(jié)果無(wú)法進(jìn)行明確歸因。（3）用純煙草花葉病毒給健康煙葉接種，健康煙葉都會(huì)發(fā)生相同病變。如果健康煙葉接種煙草花葉病毒后并沒(méi)有都發(fā)生病變，那意味著導(dǎo)致病變的并不只是煙草花葉病毒，可能還有其他未知因素參與作用。（4）從接種后發(fā)生病變的煙草葉子中仍能分離出煙草花葉病毒，而且分離出的病毒與抗煙草花葉病毒血清混合后會(huì)發(fā)生中和，亦即特異性應(yīng)答。如果發(fā)生病變的煙草葉子中未必都確定有煙草花葉病毒，那么煙草花葉病的病原體究竟是什么，仍然不能完全斷定。

斯坦利1935年在《科學(xué)》雜志上發(fā)表的那篇論文不足2頁(yè)，由于寫(xiě)得過(guò)于簡(jiǎn)練，引起一些質(zhì)疑在所難免。但他在1936年發(fā)表的一篇論文中詳細(xì)地介紹了自己的具體研究過(guò)程和所獲得的數(shù)據(jù)[33]。從中可以看出，他的煙草花葉病毒結(jié)晶研究從整體上講符合“科赫四原則”的基本精神。

比起生物學(xué)家，化學(xué)家對(duì)斯坦利的質(zhì)疑則要尖銳得多。當(dāng)時(shí)，化學(xué)家提出的主要問(wèn)題是，煙草花葉病毒結(jié)晶的純度如何？它果真只是蛋白質(zhì)？

從1935年的論文中可以看出，斯坦利從煙草花葉病毒結(jié)晶中并沒(méi)有測(cè)出磷，只是說(shuō)測(cè)出了1%的灰分，而且測(cè)出的含氮量高達(dá)20%，與已知的蛋白質(zhì)含氮量不符。這意味著他在使用硫酸銨鹽析法和硅藻土過(guò)濾法制備煙草花葉病毒結(jié)晶過(guò)程中很有可能沒(méi)有完全去除硫酸銨。在1936年的論文中，他雖然更正了含氮量的數(shù)值，但仍然沒(méi)有測(cè)出含磷量。

1936年，英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站植物病理部門(mén)的鮑頓（F. C. Bawden）和劍橋大學(xué)病理系的皮里（N. W. Pirie）合作對(duì)自己混合使用硫酸銨鹽析法和等電點(diǎn)沉淀法精制出的煙草花葉病毒結(jié)晶進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，結(jié)晶中的含氮量為16.7%，含磷量為0.5%，含糖量為2.5%。他們深入研究后指出：煙草花葉病毒大約是由95%的蛋白質(zhì)和5%的核糖核酸（RNA）組成的核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體。而且，他們還基于煙草花葉病毒溶液具有各向異性推定煙草花葉病毒顆粒呈桿狀[34]。這意味著病毒并不像人們通常想象的那樣是非常小的細(xì)菌，而是一種完全不同的實(shí)體。

鮑頓和皮里雖然證明了煙草花葉病毒中含有RNA，但是他們當(dāng)時(shí)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)RNA作為基因組攜帶著重要的遺傳信息?！癛NA具有增殖能力，亦即傳染性”直到1956年才被德國(guó)科學(xué)家吉爾（A. Gierer）和施拉姆（G. Schramm）發(fā)現(xiàn)。1956年，吉爾和施拉姆將煙草花葉病毒放在水和苯酚中震蕩，使RNA與蛋白質(zhì)分離后，再用提純過(guò)的RNA去給煙草接種，結(jié)果煙草葉子上出現(xiàn)了典型的花葉病斑。而當(dāng)用核糖核酸酶對(duì)RNA進(jìn)行處理后，再給煙草接種，煙草葉子上并不會(huì)出現(xiàn)病斑。經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證之后，吉爾和施拉姆指出，RNA是一種遺傳物質(zhì)，煙草花葉病毒的RNA成分在接種后的煙草葉片中能夠誘導(dǎo)合成出新的煙草花葉病毒。1957年，佛蘭科爾-康拉特（H. Fraenkel-Conrat）和辛格爾（B. Singer）通過(guò)病毒的重建進(jìn)一步證實(shí)了吉爾和施拉姆的上述結(jié)論[3]81-84。

鮑頓的弟子哈里森（B. D. Harrison）曾在文章中談到，鮑登和皮里當(dāng)時(shí)曾就RNA是否具有傳染性的問(wèn)題進(jìn)行過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，可能是由于兩人的實(shí)驗(yàn)室相距有50英里，等皮里把分離出的RNA運(yùn)送給鮑登時(shí)RNA已經(jīng)失活，所以鮑登和皮里未能發(fā)現(xiàn)RNA的傳染性[35]。

盡管鮑登和皮里推定煙草花葉病毒顆粒呈桿狀結(jié)構(gòu)，但是直到1939年才被柏林帝國(guó)生物學(xué)研究所的生物化學(xué)家古斯塔夫·阿道夫·考舍（Gustav Adolf Kausche，1901-1960）等人確認(rèn)。如眾所知，1933年，兩位德國(guó)年輕人恩斯特·魯斯卡（Ernst Ruska，1906-1988）與波多·馮·波里斯（Bodo von Borries，1905-1956）合作，成功地研制出了全球第一臺(tái)分辨率超過(guò)光學(xué)顯微鏡的電子顯微鏡。但這臺(tái)電子顯微鏡結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，實(shí)用性不強(qiáng)。1938年，二人在西門(mén)子公司的支持下又合作研制出2臺(tái)結(jié)構(gòu)更加合理、功能更為齊全、放大率可達(dá)3萬(wàn)倍的實(shí)用電子顯微鏡試制品，其中1臺(tái)旋即交給了恩斯特·魯斯卡的胞弟，同時(shí)也是波多·波里斯的妻兄哈爾墨特·魯斯卡（Helmut Ruska，1908-1973）測(cè)試使用（圖17）。在此基礎(chǔ)上，西門(mén)子公司于1939年正式推出第1臺(tái)商用電子顯微鏡[36]。哈爾墨特·魯斯卡當(dāng)時(shí)正在柏林大學(xué)查理特醫(yī)學(xué)院實(shí)習(xí)，他堅(jiān)信電子顯微鏡有助于促進(jìn)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展，因此1938年拿到電子顯微鏡后就開(kāi)始嘗試著用它來(lái)觀察多種亞微觀生物。1939年他又協(xié)助考舍等人使用電子顯微鏡成功地觀察到了煙草花葉病毒[37]（圖18）。

考舍等人為了增加影像的對(duì)比度，將煙草花葉病毒與膠體金混合，不僅在電子顯微鏡中觀察到了煙草花葉病毒,而且還獲得了第一張煙草花葉病毒的電鏡照片。根據(jù)考舍等人的觀察，“煙草花葉病毒分子”呈桿狀，其直徑大約為15納米，長(zhǎng)度為150或300納米。斯坦利等人1941年也使用電子顯微鏡對(duì)晶體煙草花葉病毒進(jìn)行了觀察，這兩個(gè)團(tuán)隊(duì)的觀察結(jié)果高度吻合。

這樣，自貝杰林克1898年使用“病毒”一詞特指濾過(guò)性病原體以來(lái)，人們終于用自己的眼睛看到了病毒顆粒，并確認(rèn)它是含有RNA成分、具有傳染性的核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體。只是后來(lái)隨著電子顯微鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)桿狀煙草花葉病毒體度和結(jié)構(gòu)的把握更加精準(zhǔn)罷了。

9 結(jié)語(yǔ)

19世紀(jì)末20世紀(jì)初，巴斯德、科赫等人提出的細(xì)菌致病學(xué)說(shuō)正處于鼎盛時(shí)期。受這種學(xué)說(shuō)的啟迪，德國(guó)農(nóng)業(yè)化學(xué)家麥爾發(fā)現(xiàn)煙草花葉病是一種植物傳染病，但他未能證明煙草花葉病的致病因子是一種濾過(guò)性病原體。首先在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中意識(shí)到煙草花葉病的致病因子是一種濾過(guò)性病原體的是俄國(guó)的伊萬(wàn)諾夫斯基，但他當(dāng)時(shí)并未意識(shí)到這種濾過(guò)性病原體是一種有別于細(xì)菌的新型病原體。

圖17 哈爾墨特·魯斯卡（H. Ruska，1908-1973）1938年用過(guò)的電子顯微鏡

圖18 考舍（G. A. Kausche，1901-1960）1939年拍攝的TMV電鏡照片

由于傳染病皆由細(xì)菌或其毒素引起的觀點(diǎn)獲得了廣泛認(rèn)同，因此當(dāng)可以通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器的新型病原體——口蹄疫病毒被“發(fā)現(xiàn)”之后，德國(guó)的呂夫勒和菲洛施等人仍然不愿意拋棄既有的理論和概念，繼續(xù)將這種新型病原體視作一種細(xì)菌。荷蘭學(xué)者貝杰林克雖然改造了傳統(tǒng)的“病毒”概念，并賦予其全新的涵義——“傳染性活流質(zhì)”，但很少有人能夠接受這一觀念，因?yàn)楦鶕?jù)以往的經(jīng)驗(yàn)人們很難想象非顆粒形態(tài)的流質(zhì)也像單細(xì)胞細(xì)菌那樣具有生命力。

一戰(zhàn)結(jié)束后不久，美國(guó)植物病理學(xué)家杜加爾基于自己的實(shí)驗(yàn)研究將“病毒”的概念發(fā)展成為可在細(xì)胞內(nèi)自我增殖的微粒，但他既沒(méi)有見(jiàn)到這種微粒形態(tài)的病毒，也不知道它究竟是什么。因此，當(dāng)美國(guó)生物化學(xué)家斯坦利借助當(dāng)時(shí)最先進(jìn)的酶蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)于1935年制得煙草花葉病毒結(jié)晶，并指出“病毒”是一種蛋白質(zhì)時(shí)，在學(xué)術(shù)界引起了熱議，因?yàn)檫@種“病毒”概念顛覆了很多人對(duì)生命和物質(zhì)的認(rèn)知。自我增殖被認(rèn)為是只有生命才具有的屬性，如果作為化學(xué)物質(zhì)的蛋白質(zhì)確實(shí)具有這種屬性，那么生物與非生物的界限在哪里？

盡管對(duì)斯坦利的研究表示懷疑的人有很多，但很快就用事實(shí)修正斯坦利的研究結(jié)論的唯有英國(guó)的鮑登和皮里。鮑登和皮里1936年用無(wú)可爭(zhēng)辯的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，煙草花葉病毒中除含有大量的蛋白質(zhì)外，還含有少量的RNA，只是他們當(dāng)時(shí)并沒(méi)有意識(shí)到這種RNA才是病毒的遺傳物質(zhì)。鮑登和皮里還從這種核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體具有各向異性推出，煙草花葉病毒應(yīng)該是桿狀顆粒，而不是球狀顆粒。在電子顯微鏡的發(fā)明人、1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)得主恩斯特·魯斯卡的弟弟哈爾墨特·魯斯卡的協(xié)助下，德國(guó)生物化學(xué)家考舍于1939年終于直接觀察到了煙草花葉病毒，并確認(rèn)其為桿狀顆粒。不過(guò)，考舍給出的煙草花葉病毒的大小尺寸并不準(zhǔn)確。

從最初斷定煙草花葉病毒為濾過(guò)性病原體，到終于看到這種濾過(guò)性病原體為一種亞微觀顆粒，人類(lèi)整整用了41年。在這段時(shí)間里，很多科學(xué)家都為人類(lèi)加深對(duì)病毒的理解做出了重要的貢獻(xiàn)。不可否認(rèn)的是，這些科學(xué)家雖然在研究煙草花葉病毒的過(guò)程中都得出了一些符合事實(shí)的、有價(jià)值的結(jié)論，但是他們的論文或報(bào)告中也都存在著這樣或那樣的錯(cuò)誤，要么實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全符合事實(shí)，要么構(gòu)建的病毒概念不完全正確。簡(jiǎn)言之，沒(méi)有一篇論文或報(bào)告沒(méi)有錯(cuò)誤，沒(méi)有一位科學(xué)家說(shuō)得完全正確。至于沒(méi)有為加深對(duì)病毒的理解做貢獻(xiàn)，甚至對(duì)病毒概念的形成產(chǎn)生嚴(yán)重誤導(dǎo)的論文或報(bào)告則不計(jì)其數(shù)。如果當(dāng)時(shí)的人們對(duì)這些論文或報(bào)告推崇備至，甚至將這些論文或報(bào)告的作者奉若神明，不僅不利于病毒概念的形塑，甚至?xí)璧K科學(xué)的發(fā)展。

倘若歷史上的絕大多數(shù)論文與報(bào)告都會(huì)或多或少地存在一些錯(cuò)誤，每一位科學(xué)家都會(huì)不可避免地存在一些認(rèn)識(shí)誤區(qū)，那么今人該如何看待科學(xué)認(rèn)知，如何對(duì)待科學(xué)家？尤其是，今天的科學(xué)家會(huì)不會(huì)像100年前的科學(xué)家那樣，即使在自己的專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)也會(huì)頻頻出錯(cuò)？顯然，迷信科學(xué)和盲從科學(xué)家并不能使我們更加接近真理，也無(wú)助于我們解決當(dāng)下所面臨的諸多科技難題。懷疑的世界真理多，盲信的社會(huì)謬誤多?？茖W(xué)始于疑問(wèn)，過(guò)去是如此，現(xiàn)在也應(yīng)該是這樣。

通過(guò)回顧煙草花葉病毒的發(fā)現(xiàn)過(guò)程，我們還可以看到，科學(xué)的發(fā)展是累積性的，即使是重大發(fā)現(xiàn)通常也是由很多人共同完成的。因此，有必要在科學(xué)共同體內(nèi)部建立平等對(duì)話和合作交流的機(jī)制。

只有充分發(fā)揚(yáng)學(xué)術(shù)民主，建立平等對(duì)話的機(jī)制，才有可能使每一位科學(xué)家的真知灼見(jiàn)都不至于被埋沒(méi)，同時(shí)確保任何權(quán)威的認(rèn)知盲點(diǎn)都不至于成為阻礙科學(xué)發(fā)展的絆腳石。真理越辯越明，在科學(xué)共同體內(nèi)部，批評(píng)錯(cuò)誤觀點(diǎn)和理論的方法不是壓制這種觀點(diǎn)和理論的傳播，而是提出一個(gè)更有競(jìng)爭(zhēng)力的觀點(diǎn)和理論。

要建立合作交流機(jī)制，首先需要建立一套大家都能理解的話語(yǔ)體系，不能各說(shuō)各話；其次需要搭建一批方便各國(guó)學(xué)者高效溝通的平臺(tái)，不能畫(huà)地為牢?？梢哉f(shuō)，無(wú)論是德國(guó)學(xué)者、俄國(guó)學(xué)者，還是美國(guó)學(xué)者、英國(guó)學(xué)者，如果大家在研究煙草花葉病毒過(guò)程中，不是基于普遍主義立場(chǎng)行動(dòng)，就不可能建立起那么龐大的“行動(dòng)者網(wǎng)絡(luò)”，因而也就不可能形成那么強(qiáng)大的如實(shí)表征病毒本質(zhì)的能力。

致謝

在成稿過(guò)程中，康奈爾大學(xué)科學(xué)技術(shù)論系胡萬(wàn)亨博士曾幫助搜集部分研究資料，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院昌增益教授曾提出很多中肯的修改建議，特此一并致謝！

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What is Virus: A Historical Review of Discovery of the Tobacco Mosaic Virus

Zhou Cheng1, 2

(1. Department of Philosophy, Peking University, Beijing 100871, China;2. School of Health Humanities, Peking University, Beijing 100191, China)

In the years before the advent of electron microscopy, where the “germ”, as in the dominating germ theory of disease, was confined to bacteria, how did virus, which remained invisible, come to be known? How did people manage to identify something as “virus”? This article approached these issues by studying the intellectual history of science in the discovery of the tobacco mosaic virus (TMV), while remaining fully aware that scientific research has its limitations and that knowledge resulting from it could be wrong. Specifically, this article reviews eight milestone discoveries that gradually revealed the TMV: 1) tobacco mosaic disease was transmissible by inoculating healthy plants with sap from the leaves of diseased plants (Adolf Mayer); 2) the agent that causes the disease was filterable (Dmitri Ivanowsky); 3) the agent was(Martinus Beijerinck); 4) foot-and-mouth disease in cattle was caused by the “minutest organisms” (Friedrich Loeffler & Paul Frosch); 5) the infective entity of the tobacco mosaic disease was not(Ivanowsky); 6) the disease was caused by some particle that could multiply itself in cells (Benjamin M. Duggar); 7) crystallization showed TMV as a protein (Wendell Meredith Stanley); and 8) TMV turned out to be a rod-shaped aggregate of protein containing RNA.

Germ theory; TMV; scientific discovery; scientific concept; scientific spirit

2020–02–01;

2020–02–17

中國(guó)科學(xué)院學(xué)部咨詢(xún)項(xiàng)目( 2017ZWH016A–040)

周 程（1964–），男，博士，教授，研究方向?yàn)榭茖W(xué)社會(huì)史、科學(xué)實(shí)踐哲學(xué)、創(chuàng)新管理與科技政策。E-mail: zhoucheng@pku.edu.cn

10.3724/SP.J.1224.2020.00092

N09

A

1674-4969(2020)01-0092-21