前列腺素E2促進(jìn)乙型肝炎病毒復(fù)制的機(jī)制研究

黃珊珊 趙靜雅 陳潔 楊揚

HBV會干擾宿主肝細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致持續(xù)感染以及肝損傷和炎癥[1-2]。通常慢性HBV感染的患者體內(nèi)由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的病毒特異性T細(xì)胞殺傷反應(yīng)較差甚至不存在，出現(xiàn)這種情況是由于T細(xì)胞在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的‘疲勞’現(xiàn)象所致[3-4]。T細(xì)胞‘疲勞’的主要表征為增殖能力缺乏、效應(yīng)細(xì)胞毒活性差、細(xì)胞因子產(chǎn)生受損、細(xì)胞凋亡增加以及多種抑制性受體持續(xù)表達(dá)[5-6]。但是阻斷抑制性受體途徑對于增加CTL數(shù)量及有效性的作用效果并不明顯[7]，因此需探究導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙的其他因素，為HBV感染患者提供有效的組合治療靶點。前列腺素類存在于幾乎所有的哺乳類細(xì)胞中，并且對多種刺激(如感染或者創(chuàng)傷)有反應(yīng)，可作為脂質(zhì)激素樣信號分子參與多種疾病的生理病理過程[8-9]。本研究以臨床樣本及實驗動物為研究對象，探究前列腺素類中的PGE2對HBV感染后病毒復(fù)制及CD8+T淋巴細(xì)胞功能的影響。

材料與方法

一、臨床血樣采集及檢測

選取西安大興醫(yī)院2018年1月至2018年12月慢性乙型肝炎(CHB)但未治療的患者120例和健康體檢者60名，收集血液樣本。CHB患者的診斷符合第七屆全國病毒性肝炎學(xué)術(shù)會議中制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒和艾滋病病毒(或患有自身免疫性肝病)感染的患者。

血清中HBV DNA、ALT和AST檢測采用瑞士羅氏公司提供的試劑盒。

采用人前列腺素E2(PGE2)ELISA試劑盒(上海EK-Bioscience公司)檢測血清中PGE2的濃度。采用ELISA試劑盒(瑞士Roche公司)檢測小鼠血清中HBsAg的濃度。

二、 動物實驗及分組

24只6～8周齡的C57BL/6小鼠購自西安交通大學(xué)[許可證號：SYXK(陜)2015-002]，體質(zhì)量(28±2)g。重組病毒rAAV8-1.3HBV購自北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司，參照王剛等[10]建立的HBV感染小鼠模型。采用戊巴比妥鈉將小鼠麻醉后，所有小鼠尾靜脈注射4×1010g/只rAAV8-1.3HBV，注射持續(xù)5～8 s。

然后將rAAV8-1.3HBV注射后的小鼠分為3組，對照組、PGE2組和PGE2受體拮抗組，每組各8只。PGE2組小鼠每2天注射1次PGE2的穩(wěn)定類似物16,16-dimethyl PGE2(1 mg/kg，購自美國Sigma公司)，PGE2受體拮抗組小鼠每2天注射1次PGE2受體(EP2和EP4)拮抗劑AH6809和GW627368X(1 mg/kg，購自美國Cayman公司)，對照組注射DMSO，持續(xù)2周。

三、檢測方法

(一)流式細(xì)胞儀檢測CD8+T細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo) 以密度梯度離心法從CHB患者的血樣及各組小鼠的肝臟組織中分離單核細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)記免疫熒光法測定患者血樣CD8+T淋巴細(xì)胞的占比，CD8+T淋巴細(xì)胞Tim3、顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)，以及小鼠肝臟CD8+T淋巴細(xì)胞的占比，CD8+T淋巴細(xì)胞Tim3、TNF-α和IFNγ的表達(dá)。所有熒光標(biāo)記單克隆抗體均購自美國Abcam公司。儀器采用美國BD Biosciences公司的BD FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀，BD FACS Diva 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

(二)實時定量PCR檢測血清pgRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑從各組小鼠血清中分離總RNA，采用實時定量PCR法分析各組小鼠血清中pgRNA的表達(dá)。采用SYBR Green Master試劑盒檢測pgRNA mRNA的表達(dá)。pgRNA的引物為：上游引物5′-CTCAATCTCGGGAATCTCAATGT-3′，下游引物5′-AGGATAGAACCTAGCAGGCATAAT-3′。每個樣本重復(fù)3次，β-actin為內(nèi)參。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、CHB患者血清中PGE2與病毒復(fù)制和肝損傷的關(guān)系

CHB患者血清中PGE2水平(877.20±43.27)顯著高于健康體檢者(201.30±13.38)(t=14.92，P<0.05)。PGE2高水平患者血清中HBV DNA、ALT和AST水平顯著高于PGE2低水平患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組患者血清HBV DNA、ALT和AST水平對比(±s)

二、CHB患者血清中PGE2與CD8+T淋巴細(xì)胞功能的關(guān)系

與PGE2低水平患者相比，PGE2高水平患者血樣CD8+T細(xì)胞Tim3的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，顆粒酶B的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。穿孔素的表達(dá)及CD8+T細(xì)胞的占比在兩組患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組患者血樣中CD8+T淋巴細(xì)胞功能對比(%,±s)

三、PGE2促進(jìn)HBV復(fù)制

與對照組相比，PGE2組小鼠血清中HBsAg、HBV DNA及pgRNA水平顯著增加(P<0.05)，PGE2受體拮抗組小鼠血清中HBV DNA及pgRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清中HBsAg、HBV DNA及pgRNA水平對比(±s)

注：與對照組相比，*P<0.05

四、CD8+T淋巴細(xì)胞參與PGE2對HBV復(fù)制的調(diào)控

與對照組相比，PGE2組小鼠肝臟CD8+T淋巴細(xì)胞Tim3的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，TNF-α和IFNγ的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。PGE2受體拮抗組小鼠肝臟CD8+T淋巴細(xì)胞中Tim3的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，TNF-α的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，IFNγ的表達(dá)無顯著變化。3組小鼠肝臟中CD8+T淋巴細(xì)胞的占比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 各組小鼠肝臟中CD8+T淋巴細(xì)胞功能對比(%, ±s)

注：與對照組相比，*P<0.05

討 論

研究報道，具有致病表型的Th17細(xì)胞可介導(dǎo)PGE2促進(jìn)HBV誘導(dǎo)的免疫損傷[11-12]。本研究結(jié)果顯示，PGE2在CHB患者血清中的水平顯著高于健康體檢者，且PGE2高水平患者血清中HBV DNA、ALT和AST的含量顯著高于PGE2低水平患者，這些結(jié)果提示CHB患者肝損傷可能與PGE2水平的增加有關(guān)，且由于血清HBV DNA含量的增加，推測PGE2促進(jìn)HBV復(fù)制可能是其誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制之一。但是PGE2參與多種細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)過程，此推斷是否成立還需要進(jìn)一步驗證。

研究報道，抑制性受體的持續(xù)表達(dá)與T細(xì)胞免疫衰竭有關(guān)[13]。本研究顯示，PGE2高水平患者血清中CD8+T細(xì)胞Tim3的表達(dá)顯著增加，提示PGE2可能是通過調(diào)控抑制性受體Tim3的表達(dá)來促進(jìn)T細(xì)胞衰竭。對慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染和HIV感染的研究中發(fā)現(xiàn)，PGE2對CTL細(xì)胞的存活及有效性具有抑制作用[14-15]。CTL細(xì)胞釋放的穿孔素和顆粒酶可殺傷靶細(xì)胞(病毒、腫瘤細(xì)胞等抗原物質(zhì))，對腫瘤及感染類疾病的治療具有積極的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PGE2高水平患者血清中顆粒酶B的表達(dá)顯著低于PGE2低水平患者，穿孔素的表達(dá)也有降低的趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，由此推斷PGE2可降低CTL細(xì)胞釋放的穿孔素和顆粒酶，進(jìn)而抑制CTL細(xì)胞對病毒的殺傷性。

PGE2通過與其受體(EP1、EP2、EP3和EP4)結(jié)合調(diào)控炎癥、免疫反應(yīng)、血壓等多種病理過程[16-17]。為探討PGE2及其受體在HBV感染后病毒復(fù)制及CD8+T細(xì)胞免疫調(diào)控中的作用，本研究將PGE2穩(wěn)定類似物或者PGE2受體(EP2和EP4)拮抗劑注射入rAAV8-1.3HBV質(zhì)粒感染小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGE2類似物可增加HBV感染小鼠血清中HBV DNA的水平，而PGE2受體拮抗劑顯著降低HBV DNA水平，這些結(jié)果進(jìn)一步證實PGE2可通過與其受體EP2和EP4結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)HBV的感染及復(fù)制過程。

血清中pgRNA的含量可反映肝臟中HBV共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的活性，HBV cccDNA可形成微染色體穩(wěn)定存在于細(xì)胞核中，其難以清除是HBV感染慢性化和停藥后復(fù)發(fā)的重要原因[18]。因此檢測血清中pgRNA水平對于評價HBV感染進(jìn)程及復(fù)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。本研究中，PGE2類似物顯著增加HBV感染小鼠血清中pgRNA的水平，PGE2受體拮抗劑顯著降低pgRNA的水平。提示PGE2在評價HBV感染進(jìn)程及復(fù)發(fā)中具有重要意義，且PGE2受體阻斷能顯著縮短HBV感染進(jìn)程，降低復(fù)發(fā)。

雖然PGE2及其受體拮抗劑對CD8+T細(xì)胞的數(shù)量無影響，但PGE2可能影響CD8+T細(xì)胞的功能。檢測CD8+T細(xì)胞抑制性受體(Tim3)及細(xì)胞因子(TNF-α和IFNγ)的表達(dá)結(jié)果證實，PGE2類似物顯著增加CD8+T細(xì)胞Tim3的表達(dá)，降低TNF-α和IFNγ的表達(dá)。PGE2受體拮抗劑有相反的作用。TNF-α可抑制腫瘤發(fā)生和病毒復(fù)制[19]，IFNγ是免疫干擾素，在抗病毒的先天免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[20]。因此這些結(jié)果進(jìn)一步證實PGE2促進(jìn)HBV的復(fù)制，且損傷CD8+T細(xì)胞的免疫清除。PGE2受體拮抗劑可緩解T細(xì)胞的免疫衰竭。本研究也有不足之處，樣本量太少、缺乏細(xì)胞水平的研究及對機(jī)制的深入探討，將會在后續(xù)研究中進(jìn)行深入分析。

總之，PGE2在CHB患者血清中呈高表達(dá)，PGE2促進(jìn)HBV復(fù)制及T細(xì)胞衰竭，PGE2信號阻斷不僅可修復(fù)T細(xì)胞功能還可控制HBV復(fù)制。因此PGE2阻斷將可能成為CHB患者治療的新策略。