抗癌防移片對BALB/c小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移HGF、VEGF蛋白表達(dá)的影響*

★ 郭忠聰 龔純 文枝 何飄 王理槐*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙 40007；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 長沙 40007）

關(guān)鍵字：抗癌防移片；大腸癌肝轉(zhuǎn)移；血管新生；肝細(xì)胞生長因子（HGF）；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）

大腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，影響大腸癌患者預(yù)后的最大問題就是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［1］。在我國，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，居民生活習(xí)慣、 飲食結(jié)構(gòu)變化以及人口結(jié)構(gòu)年齡老齡化， 我國的大腸癌發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升［2］。而我國大腸癌診斷時(shí)Ⅰ期的比例僅占5%， 超過60%的大腸癌患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期。因此，我國現(xiàn)在面臨大腸癌發(fā)病迅速上升但早期診斷比例低的嚴(yán)峻形勢。目前手術(shù)是治療大腸癌的主要方法，但大腸癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率很高，約40%～70%的大腸癌患者于5年內(nèi)死于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［3］。肝臟是大腸癌轉(zhuǎn)移最好發(fā)部位，25%的患者發(fā)現(xiàn)癌腫時(shí)已有肝轉(zhuǎn)移，另外25%在2年內(nèi)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，如此高的肝轉(zhuǎn)移率說明肝臟可提供有助于轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞建群和發(fā)展的環(huán)境條件［4］。目前西醫(yī)臨床上預(yù)防大腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移主要采用化療和放療為主，但化、放療影響機(jī)體的免疫功能，致腫瘤患者的免疫低下狀態(tài)惡化，且部分患者因不能耐受化、放療的毒副作用而導(dǎo)致治療的終止而影響療效［5］。中醫(yī)藥獨(dú)特的對免疫功能調(diào)節(jié)作用和其毒副反應(yīng)少的特性正好彌補(bǔ)了西醫(yī)化、放療的不足，具有廣闊的應(yīng)用前景［6］。本次研究是在建立小鼠大腸癌模型基礎(chǔ)上，通過不同處理方式，觀察各組大腸組織標(biāo)本中HGF、VEGF蛋白表達(dá)，探討HGF與VEGF兩者之間是否存在直接關(guān)聯(lián)性；抗癌防移片（ACMS）是否通過影響HGF、VEGF蛋白的表達(dá)降低大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c小鼠共48只。雌雄各半，體重 20～25g，6～8 周齡。

1.1.2 藥物組成 抗癌防移片（ACMS）系三湘名醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方（由紅參、半枝蓮、黃芪、薏苡仁、姜黃、女貞子、墨旱蓮、莪術(shù)、九香蟲、枸杞子、白術(shù)、湘曲組成，湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，批號040106）。陽性對照藥使用奧沙利鉑（L-OHP）；5-氟尿嘧啶；亞葉酸鈣（CF）。

1.1.3 主要試劑 小鼠HGF、VEGF試劑盒；免疫組化染色試劑盒；HGF、VEGF多克隆抗體；SABC試劑盒；DAB顯色劑試劑盒等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法 腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉BALB/c鼠，于背側(cè)中部、左側(cè)腋中線與腋后線間，取1.5cm左右切口進(jìn)腹，顯露脾臟，于脾臟上極沿脾臟縱軸進(jìn)針，邊退邊注入CT26細(xì)胞懸液（1×10個/mL），后用蘸有絡(luò)合碘的消毒棉簽輕一壓針眼處數(shù)秒，查看無出血后，將脾臟放回原位，全層縫合腹壁。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組將造模后的BALB/c小鼠按隨機(jī)分為4組，每組12只：模型組，西藥組，中藥組，中西藥組。模型組小鼠以生理鹽水0.5mL灌胃，1次/d；西藥組小鼠以（L-OHP+5-FU+CF）治 療，L-OHP 1mg、5-Fu 4mg、CF 0.4mg，腹 腔注射，1次/周；中藥組小鼠分別以ACMS混懸液0.5mL灌胃，各相當(dāng)于60kg成人用量的5倍；中西藥組小鼠以（ACMS+L-OHP+5-FU+CF）治療：抗癌防移片0.1mL灌胃，1次/d、L-OHP 1mg，5-Fu 4mg，CF 0.4mg，腹腔注射，1次/周。實(shí)驗(yàn)各組于移植后第7d開始給藥，共治療4周。

1.2.3 觀察指標(biāo)及方法 免疫組織化學(xué)測定HGF、VEGF蛋白表達(dá)光鏡下觀察，陽性染色細(xì)胞胞漿或胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。采用IPP6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每個組每個時(shí)間點(diǎn)分別選取5張切片，每張切片隨機(jī)選取5個視野，測定陽性著色累積光密度（IOD）值，對HGF進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)（x）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的均數(shù)比較采用單因素方差（ANOVA）分析。同一時(shí)間點(diǎn)的組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF和VEGF蛋白表達(dá) 在大腸癌表達(dá)的相關(guān)性見表1，HGF的表達(dá)和VEGF的表達(dá)顯著相關(guān)（P＜0.05）。蛋白表達(dá)陽性判定是觀察在細(xì)胞核或胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒。結(jié)果判定采用的是半定量計(jì)分法。①選染色均勻的陽性表達(dá)區(qū)域，以著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的多少計(jì)分：0分：≤5%；1分：6%～25%；2分：26% ～50%；3分：51%～75%；4分：＞75%。②顯色度計(jì)分：高倍鏡（×400）下取表達(dá)最強(qiáng)的部位，按顯色程度計(jì)分，顯色與背景相似者為0分；顯色淺，略高于背景為1分；中度顯色，明顯高于背景為2分；強(qiáng)染，顯色深棕色為3分。③總積分將上述兩種積分乘積為0表示陰性（-），＞1分為陽性，其中1-2分表示弱陽性（+），3-4分表示陽性（++），≥5分表示強(qiáng)陽性（+++）。

表1 HGF和VEGF在48例BALB／c小鼠大腸組織表達(dá)情況

2.2 48例造模成功的大腸癌小鼠模型，在經(jīng)過不同處理方式后，出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移的例數(shù)與HGF、VEGF相關(guān)性見表2，經(jīng)數(shù)據(jù)分析后兩者之間呈正相關(guān)性（P＜0.05）。

表2 HGF和VEGF與出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移例數(shù)

2.3 HGF、VEGF蛋白表達(dá)的檢測 不同組別HGF、VEGF蛋白表達(dá)比較如圖1所示。BALB/c小鼠大腸組織中HGF、VEGF蛋白電泳帶的灰度值比較見表3。HGF與VEGF數(shù)據(jù)相比，兩者呈正相關(guān)。四組數(shù)據(jù)P＞0.05，滿足方差齊性檢驗(yàn)。模型組HGF、VEGF蛋白電泳無明顯變化，中西結(jié)合組與西藥組HGF、VEGF蛋白電泳表達(dá)明顯下降（**P＜0.01）。

圖1 各組BALB／c小鼠大腸組織中HGF、VEGF蛋白Western Blot電泳條帶

表3 各組小鼠大腸組織中HGF、VEGF蛋白表達(dá)比較（±s，n=12）

表3 各組小鼠大腸組織中HGF、VEGF蛋白表達(dá)比較（±s，n=12）

注：模型組與中西結(jié)合組相比，ΔP＜0.01，中西結(jié)合組與西藥組相比，*P＞0.05。

分組 HGF蛋白表達(dá) VEGF蛋白表達(dá)中西結(jié)合組 0.043±0.067Δ* 0.036±0.051Δ*西藥組 0.281±0.039* 0.315±0.014*中藥組 0.462±0.257 0.432±0.086模型組 0.714±0.210Δ 0.809±0.137Δ

3 討論

中醫(yī)學(xué)雖無“大腸癌”這一名稱，但古代醫(yī)學(xué)典籍中有眾多的描述，如《靈樞·水脹》中其腸覃癥狀的描述頗似結(jié)腸癌腹內(nèi)結(jié)塊的表現(xiàn)，“腸覃何如？岐伯曰：寒氣客于腸外，與衛(wèi)氣相搏……肉乃生。其始也，大如雞卵，稍以益大，至其成也，如懷子之狀，久者離歲，按之則堅(jiān)，推之則移。”明代《外科正宗·臟毒》中描述的病癥與大腸癌的病因、主要癥狀基本符合，并明確指出預(yù)后不良，“蘊(yùn)毒結(jié)于臟腑，火熱流注肛門，結(jié)而為腫，其患痛連小腹，肛門墜重，二便乖違，或?yàn)a或秘，肛門內(nèi)蝕，串爛經(jīng)絡(luò)，污水流通大孔，無奈飲食不餐，作渴之甚，凡此未得見其生?！鼻宕锻饪拼蟪伞S痔漏》說道鎖肛痔與直腸癌癥狀特征基本符合，“鎖肛痔，肛門內(nèi)外猶如竹節(jié)鎖緊，形如海蜇，里急后重，便糞細(xì)而帶扁，時(shí)流臭水，此無治法?！惫士蓮闹锌偨Y(jié)，大腸癌應(yīng)屬中醫(yī)學(xué)的“腸積”“積聚”“癥瘕”“腸覃”“腸風(fēng)”“臟毒”“下痢”“鎖肛痔”等病的范疇［7］。對于大腸癌病因病機(jī)，認(rèn)為腫瘤的發(fā)生是由于正氣不足，臟腑功能失調(diào)，氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而形成，表現(xiàn)為局部屬實(shí)，全身屬虛的病癥［8］。隨著病情進(jìn)一步發(fā)展，痰瘀毒結(jié)愈盛，加之治療時(shí)攻伐太過，正氣虧虛日甚，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。全身正氣虧損乃腫瘤轉(zhuǎn)移之根本，局部氣血瘀滯、痰毒瘀結(jié)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［9］。

抗癌防移片系三湘名醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，由紅參、半枝蓮、黃芪、薏苡仁、姜黃、女貞子、墨旱蓮、莪術(shù)、九香蟲、枸杞子、白術(shù)、湘曲組成。方中以紅參為君，有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，益氣攝血的作用，以復(fù)身體之正氣，抗腫瘤頑固之邪氣，黃芪補(bǔ)氣固表，白術(shù)、薏苡仁益氣健脾，湘曲消食健胃，脾胃為氣血生化之源，助紅參補(bǔ)氣之功；女貞子滋補(bǔ)肝腎，墨旱蓮補(bǔ)腎益精，枸杞子滋補(bǔ)肝腎，肝腎得補(bǔ)，氣血調(diào)和，陰陽互生。臟腑功能協(xié)調(diào)，氣血充足以抗腫瘤之邪。半枝蓮味辛、苦，性寒，清熱解毒，化瘀利尿，以祛腫瘤頑固之瘀毒；莪術(shù)行氣破血，以消腫瘤癥瘕積聚之結(jié)塊，九香蟲、姜黃行氣破血，加強(qiáng)莪術(shù)消癥瘕之功。全方合用，共奏益氣扶正，化瘀解毒之功。前期臨床應(yīng)用觀察表明，抗癌防移片對乳腺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移有抑制作用，在我們的長期臨床應(yīng)用也發(fā)現(xiàn)，抗癌防移片對大腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移也有類似的預(yù)防作用。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是一個依賴血管生成的過程，近年的研究證明促血管內(nèi)皮生長因子與腫瘤的轉(zhuǎn)移密相關(guān)［10］。肝細(xì)胞生長因子（HGF）具有顯著地促細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞運(yùn)動；促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和新血管生成；抑制細(xì)胞凋亡，促血管內(nèi)皮細(xì)胞再修復(fù)，抗纖維化等多種生物學(xué)作用［11］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，對于誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂具有高度特異性，能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并促進(jìn)血管形成，為腫瘤細(xì)胞生長發(fā)育提供營養(yǎng)，為腫瘤新生血管網(wǎng)的建立提供保障，并為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供管道［12］。在本次研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，第一：HGF與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)性，且兩個蛋白的表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展也成正相關(guān)性，但HGF是否通過何種機(jī)制調(diào)控大腸癌組織中VEGF表達(dá)尚需要進(jìn)一步研究。第二：經(jīng)抗癌防移片和西藥一起聯(lián)合干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組別，HGF、VEGF蛋白表達(dá)量最低，與模型組比較，HGF、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與中藥組比較，HGF、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；中西結(jié)合組與西藥組比較，HGF、VEGF蛋白表達(dá)下降（P＞0.05）。從本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果分析可得出，抗癌防移片預(yù)防肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與抑制HGF、VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。