HPLC法比較不同產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量的差異

李佳偉， 呂 寒， 劉 艷， 鮮 新， 丁曉琴， 簡(jiǎn)暾昱， 任冰如， 陳 劍

〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省抗糖尿病藥物篩選技術(shù)服務(wù)中心， 江蘇 南京 210014〕

枇杷葉為薔薇科(Rosaceae)植物枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.〕的干燥葉，為中國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥材，味苦，性微寒，具有清肺止咳、降逆止嘔、抗氧化、抗炎、降血糖和保肝護(hù)肝的功效[1-3]。枇杷葉的主要成分包括黃酮類[4]、三萜酸類[5-7]、倍半萜苷類[8]、多酚[9]和多糖[10]等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明：枇杷葉中倍半萜苷類成分可緩解高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝[11]，枇杷葉中的倍半萜苷A具有顯著的降血糖作用[12]。

本研究以采自10個(gè)省(自治區(qū))12個(gè)產(chǎn)地的枇杷葉為研究對(duì)象，建立高效液相色譜(HPLC)測(cè)定枇杷葉中倍半萜苷A含量的方法，并比較不同產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量的差異，以期為不同產(chǎn)地枇杷葉的采收和開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試枇杷葉于2019年6月采自廣西玉林和梧州、浙江蘭溪、廣東清遠(yuǎn)和肇慶、江蘇南京、四川綿陽(yáng)、重慶沙坪壩、安徽亳州、河南開封、湖北恩施以及湖南湘西10個(gè)省(自治區(qū))的12個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所任冰如研究員鑒定為枇杷的葉。每個(gè)產(chǎn)地采集新鮮成熟枇杷葉1 kg，40 ℃烘干，粉碎后過50目篩，備用。

主要儀器：EL204電子天平〔梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司〕，KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Milli-QTMAdvantage A10TM超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)，Dione Ultimate-3000液相色譜儀(配有四元泵、在線真空脫氣、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)系統(tǒng)和Chromeleon工作站，美國(guó)DIONEX公司)。

主要試劑：倍半萜苷A對(duì)照品(自制，純度95%以上)，甲醇為色譜純農(nóng)殘級(jí)(美國(guó)Tedia公司)，超純水，無水乙醇為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Nucleosil 100 C18(150 mm×4.6 mm，3.0 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水溶液(體積比65∶35)，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取倍半萜苷A對(duì)照品適量，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度4.110 mg·mL-1的對(duì)照品母液，然后用甲醇將對(duì)照品母液梯度稀釋成質(zhì)量濃度2.055、1.028、0.514、0.257、0.128和0.064 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。按照上述色譜條件測(cè)定倍半萜苷A的峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，倍半萜A質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到峰面積與倍半萜苷A質(zhì)量的回歸方程為Y=3.006 8X-0.093 8(r=0.999 7)，線性范圍為0.000 6～0.041 1 mg。

1.2.3 樣品中倍半萜苷A的提取及含量測(cè)定 分別精密稱取各樣品粉末5.00 g，精密加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇100.0 mL，超聲(300 W，30 ℃)提取60 min，冷卻后過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，用甲醇復(fù)溶轉(zhuǎn)移至5.0 mL容量瓶中定容，即為供試液。根據(jù)峰面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中倍半萜苷A質(zhì)量。然后根據(jù)公式“枇杷葉中倍半萜A含量=(枇杷葉中倍半萜A質(zhì)量/枇杷葉質(zhì)量)×100%”計(jì)算枇杷葉中倍半萜A含量。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度考察 取倍半萜苷A對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄倍半萜苷A對(duì)照品的峰面積和保留時(shí)間，RSD值分別為0.42%和0.10%，表明儀器精密度良好。

1.2.4.2 穩(wěn)定性考察 取江蘇南京產(chǎn)地樣品粉末，按照上述方法制備供試液，分別于配制后0、2、4、8、16和24 h進(jìn)行測(cè)定，RSD值為2.04%，表明供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.4.3 重復(fù)性考察 取江蘇南京產(chǎn)地樣品粉末6份，按照上述方法制備供試液，按照上述色譜條件測(cè)定倍半萜苷A峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中倍半萜苷A質(zhì)量，RSD值為0.82%，表明該方法重復(fù)性好。

1.2.4.4 加樣回收率考察 取廣西梧州產(chǎn)地樣品粉末(倍半萜苷A含量已知)6份，每份5.00 g，分別加入質(zhì)量濃度4.110 mg·mL-1倍半萜苷A對(duì)照品母液7.5 mL，再加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇100.0 mL，按照上述樣品中倍半萜苷A的提取方法和色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算倍半萜A質(zhì)量，并計(jì)算回收率，平均回收率為98.86%，RSD值為1.80%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

不同產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量見表1。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量由高到低依次為廣西梧州、四川綿陽(yáng)、廣東肇慶、安徽亳州、浙江蘭溪、重慶沙坪壩、湖南湘西、江蘇南京、湖北恩施、廣東清遠(yuǎn)、廣西玉林、河南開封。廣西梧州產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量最高，為1.412 mg·g-1，河南開封產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量最低，為0.613 mg·g-1，2個(gè)產(chǎn)地間存在顯著差異；四川綿陽(yáng)、廣東肇慶、安徽亳州、浙江蘭溪和重慶沙坪壩產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量也較高，均高于1.000 mg·g-1?？傮w上看，與華中地區(qū)的河南開封、湖南湘西和湖北恩施產(chǎn)地相比，華南、西南和華東地區(qū)的廣西梧州、四川綿陽(yáng)、廣東肇慶、安徽亳州、浙江蘭溪和重慶沙坪壩產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量較高。此外，來自同一省(自治區(qū))不同城市的枇杷葉中倍半萜苷A含量也存在顯著差異，如廣西梧州與玉林產(chǎn)地以及廣東肇慶與清遠(yuǎn)產(chǎn)地。

產(chǎn)地LocalitySGA/(mg·g-1)1)RSD/%廣西玉林Yulin of Guangxi0.678±0.008d1.24廣西梧州Wuzhou of Guangxi1.412±0.009a0.62浙江蘭溪Lanxi of Zhejiang1.092±0.007b0.67廣東清遠(yuǎn)Qingyuan of Guangdong0.682±0.015d2.14廣東肇慶Zhaoqing of Guangdong1.137±0.012b1.07江蘇南京Nanjing of Jiangsu0.921±0.020c2.16四川綿陽(yáng)Mianyang of Sichuan1.249±0.036a2.85重慶沙坪壩Shapingba of Chongqing1.036±0.009c0.91安徽亳州Bozhou of Anhui1.093±0.025b2.25河南開封Kaifeng of Henan0.613±0.037d6.00湖北恩施Enshi of Hubei0.848±0.038c4.45湖南湘西Xiangxi of Hunan0.934±0.062c6.59

1)SGA： 倍半萜苷A含量Sesquiterpene glycoside A content. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

3 討 論

本研究建立了HPLC測(cè)定枇杷葉中倍半萜苷A含量的方法，并比較了不同產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量的差異。結(jié)果表明：該方法適于測(cè)定枇杷葉中倍半萜苷A含量，操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果線性關(guān)系良好，重復(fù)性好。

植物次生代謝產(chǎn)物的合成受光照、土壤和大氣等因子的調(diào)控[13]。倍半萜苷是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，不同產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境對(duì)其合成和積累有一定影響。與中國(guó)南部地區(qū)相比，北部地區(qū)降水量少，不利于土壤中有機(jī)質(zhì)的輸入與積累[14]，這可能是影響植物次生代謝產(chǎn)物合成的一個(gè)重要因子。本研究結(jié)果顯示：不同產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量差異較大，廣西梧州產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量最高，河南開封產(chǎn)地枇杷葉中倍半萜苷A含量最低，前者為后者的2.3倍，廣西梧州可作為枇杷葉優(yōu)選產(chǎn)地。馬哲龍等[15]的研究結(jié)果表明：同一產(chǎn)地不同品種和不同采收時(shí)期枇杷葉中齊墩果酸、熊果酸和總黃酮的含量存在差異。本研究中，來自同一省(自治區(qū))不同城市的枇杷葉中倍半萜苷A含量存在顯著差異，這說明植物次生代謝產(chǎn)物除受到生態(tài)環(huán)境等外在因子影響外，種內(nèi)遺傳差異以及采收時(shí)期也可能對(duì)其有較大影響。本研究?jī)H根據(jù)產(chǎn)地對(duì)枇杷葉中倍半萜苷A含量進(jìn)行了分析，而枇杷葉中倍半萜苷A的合成受多種因子影響，有待進(jìn)一步的深入研究。