牦牛、犏牛TB-RBP基因克隆及在睪丸組織中的表達(dá)

柴志欣，王 會，王吉坤，王嘉博，鐘金城

(西南民族大學(xué)，青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是中亞帕米爾高原的特有家畜，是高原地區(qū)主要的畜種資源和牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要基礎(chǔ)。然而牦牛的生長速度慢，成熟期晚，產(chǎn)乳、產(chǎn)肉等生產(chǎn)性能較低。為提高牦牛的經(jīng)濟(jì)效益，將牦牛與普通牛進(jìn)行種間雜交改良，雜種F1犏牛產(chǎn)肉量、產(chǎn)奶量均有提高，雜種優(yōu)勢顯著。但F1公犏牛因生精機(jī)能紊亂表現(xiàn)為不育，而母犏?？捎?，使其雜種優(yōu)勢的利用和牦牛優(yōu)良遺傳資源的研究受到限制。而犏牛雄性不育的最終表現(xiàn)是精子發(fā)生受阻[1-3]。犏牛雄性不育是物種間生殖隔離的表現(xiàn)之一，其形成機(jī)制應(yīng)與精子發(fā)生、物種生殖隔離和分化相關(guān)，而基因或基因網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致基因功能的異常應(yīng)該是產(chǎn)生這一生殖隔離的主要原因。

睪丸、腦RNA結(jié)合蛋白(Testis brain RNA-binding protein，TB-RBP)是一類特異性靶向結(jié)合蛋白，可與睪丸、腦組織中的魚精蛋白1(Prm1)、魚精蛋白2(Prm2)、激酶A 錨定蛋白4等靶基因mRNA特異結(jié)合。在精子發(fā)育過程中，TB-RBP主要對減數(shù)分裂后部分靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，是調(diào)節(jié)精子活力，維持精子正常形態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一。TB-RBP可與mRNA非翻譯區(qū)保守元件特異性結(jié)合來保持mRNA穩(wěn)定，且在多數(shù)靶基因mRNA-3′(UTR)包含TB-RBP的保守結(jié)合序列。精子發(fā)生是一個復(fù)雜的調(diào)控過程，基因的表達(dá)水平、基因的網(wǎng)絡(luò)互作對精子發(fā)育成形，形成成熟、正常有生育能力的精子具有重要作用。而減數(shù)分裂階段是精子發(fā)生的重要過程，靶基因Akap4可引導(dǎo)蛋白激酶A與磷酸化位點(diǎn)靶向結(jié)合，同時參與由cAMP介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)精子活力，該基因作為精子纖維鞘組成部分維持其固有形態(tài)[4-5]。

自20世紀(jì)50年代以來，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了許多研究，利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法探討牦牛與普通牛遠(yuǎn)緣雜交后代雄性不育與漸進(jìn)可育的遺傳機(jī)理及其規(guī)律，對最終解決種間雜交雄性不育這一牦牛改良的關(guān)鍵技術(shù)難題具有十分重要的意義。本研究通過對精子發(fā)生過程關(guān)鍵基因TB-RBP進(jìn)行克隆，分析其在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步從分子水平開展犏牛雄性不育的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)并提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

TRIzol RNA提取試劑盒(Thermo)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)、pMD19-T載體(TaKaRa)；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)，質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DEPC 原液及Taq Master Mix(2×)(Thermo)，其他常用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣品采集及總RNA提取

在青海省大通種牛場選取6頭健康犏牛(1歲1頭，2歲3頭，3歲2頭)，在四川省九龍縣選取3頭健康成年牦牛(7歲)；去勢后采集睪丸組織，DEPC水沖洗后迅速放入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

采用TRIzol法提取牦牛和犏牛睪丸組織總RNA，置-80 ℃保存或立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用紫外分光光度計和全自動電泳檢測RNA濃度和純度。

1.3 cDNA第一鏈的合成

以提取睪丸組織總RNA為模板，采用RNA PCR Kit9(AMV)Ver.3.0試劑盒，Oligo-dT為引物，合成cDNA第一條鏈。反應(yīng)條件：45 ℃，45 min；99 ℃，5 min；5 ℃保存。反應(yīng)體系為：MgCl22 μL，10×RT Buffer，dNTP Mixture 1 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，OligodT-Adaptor Primer 0.5 μL，總RNA 1 μL，RNase Free ddH2O 3.75 μL。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)文獻(xiàn)資料及NCBI已發(fā)表TB-RBP基因(NM_001076006和XM_001250367)核苷酸序列，采用Primer 5.0 設(shè)計特異性引物，送英濰捷基(上海)生物科技有限公司合成，基因克隆及熒光定量引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 PCR擴(kuò)增及RT-PCR反應(yīng)

TB-RBP基因克隆反應(yīng)體系為：MasterMix 25 μL，上下游引物(20 nmoL/μL)各1 μL，cDNA模板4 μL，加去離子水至50 μL。PCR擴(kuò)增程序，具體見表2。

采用SYBR Green Ⅰ染料法在BIO-RADC10000熒光定量儀上進(jìn)行。以cDNA為模板，反應(yīng)采用25 μL體系：SYBR?Premix Ex Taq(2×)12.5 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、cDNA 2 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、ddH2O 9 μL。反應(yīng)程序見表2。

表2 PCR 擴(kuò)增程序

1.6 質(zhì)粒提取及酶切鑒定

將已提取的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為：HindⅢ 1 μL，EcoRⅠ 1 μL，1×mol/L Buffer 4 μL，質(zhì)粒DNA 5 μL，去離子水7 μL。37 ℃酶切1 h左右，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)酶切結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA純度檢測

采用分光光度法測定所提總RNA，OD260/280≈2.0，并采用全自動電泳儀(BIO-RED)檢測到明顯的18S、28S和5S條帶及波峰，且18S、28S波峰區(qū)域比值、片段區(qū)域比值、18S與28S的比較結(jié)果及總RNA區(qū)域值和濃度值，都說明RNA質(zhì)量較高，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求，檢測結(jié)果見圖1。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄檢測獲得TB-RBP基因引物1擴(kuò)增片段為587 bp，引物2擴(kuò)增片段713 bp，條帶清晰明亮，與預(yù)期片段大小一致(圖2)，純化回收后，送公司測序。

圖1 總RNA電泳圖

A.1引物；B.2引物。1-2.犏牛；3-4.牦牛。

2.3 重組子質(zhì)粒PCR及酶切鑒定

利用藍(lán)白斑遺傳學(xué)篩選法挑取白色單一菌落，置于含Ampr/LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對重組子菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，TB-RBP基因的質(zhì)粒均擴(kuò)增出目的條帶(圖3-A)。初步證明目的基因片段已重組到載體上。

將所提重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切消化，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測顯示得到2條片段，分別為2 692 bp的載體序列和目的片段(圖3-B)，證明目的片段已成功克隆，并且可以確定目的片段為正向插入。在圖3中，1、3泳道分別為犏牛TB-RBP引物1、2質(zhì)粒及酶切PCR產(chǎn)物，2、4泳道分別為牦牛TB-RBP引物1、2質(zhì)粒及酶切PCR產(chǎn)物。

圖3 質(zhì)粒PCR(A)及酶切(B)鑒定圖

2.4 TB-RBP基因序列分析

克隆所得牦牛(GenBank上傳序列號 No.：EF432559)TB-RBP基因CDS全序列873 bp，獲得犏牛(GenBank上傳序列號 No.： EF432558)TB-RBP基因部分CDS區(qū)序列587 bp。犏牛同牦牛和GenBank中海福特牛(No.： BC120296)部分CDS序列進(jìn)行比對(圖4)，結(jié)果表明：牦牛與犏牛序列相比，存在8處堿基突變，一致性為98.6%；牦牛與普通牛序列相比，共有6處發(fā)生堿基變異，一致性為98.4%；犏牛與普通牛序列相比，共有3處發(fā)生堿基變異，一致性為99.2%。

2.5 進(jìn)化樹分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫搜集13個物種TB-RBP基因CDS序列，利用MEGA 5.2.2軟件對牦牛、黃牛、水牛等13個物種TB-RBP基因CDS區(qū)核苷酸序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。共聚為兩大類，其中九龍牦牛與野牦牛、美洲野牛、犏牛遺傳距離較近，并與普通牛聚為一類，印度水牛與其他物種聚為另一大類(圖5)，說明不同物種TB-RBP基因編碼區(qū)序列高度保守，遺傳相似性較高。

2.6 氨基酸序列理化特性預(yù)測與分析

利用ExPASy在線分析軟件ProtParam程序?qū)﹃笈B-RBP蛋白編碼氨基酸的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，其氨基酸組成見表3。牦牛TB-RBP基因共編碼290個氨基酸，相對分子量為33.179 ku，理論等電點(diǎn)pI=7.72，帶負(fù)電荷殘基(Asp + Glu)總數(shù)為41個，正電荷殘基(Arg + Lys)總數(shù)為42個，其中絲氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)數(shù)量較多，分別為25，24，22個。不穩(wěn)定指數(shù)為45.06，表明此類蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為79.28，親水性指數(shù)(GRAVY)為-5.550，應(yīng)用ExPASy-ProtScale程序計算TB-RBP疏水性，蛋白質(zhì)中存在4個明顯的疏水區(qū)，分別是33-40位，127-145位，184-205位，271-280位，此蛋白為親水性蛋白。而犏牛TB-RBP基因部分CDS區(qū)序列587 bp，編碼193個氨基酸，相對分子量為47.521 ku，理論等電點(diǎn)PI=5.20，其中氨基酸組成僅包含Ala(A)34.9%，Cys(C)17.9%，Gly(G)22.8%，The(T)24.4%；不穩(wěn)定指數(shù)41.44，犏牛該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，與牦牛TB-RBP蛋白性質(zhì)一致；脂肪系數(shù)34.92，GRAVY為0.814，犏牛TB-RBP屬親水性蛋白。

圖4 牦牛、犏牛、普通牛TB-RBP基因核苷酸序列比較

表3 牦牛TB-RBP基因cDNA推測編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

2.7 蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

2.7.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 通過HNN http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl在線對TB-RBP氨基酸序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖6)。

h.α螺旋；c.無規(guī)則卷曲；e.β折疊。

結(jié)果顯示，在牦牛TB-RBP分子中，存在7個較為明顯的α螺旋(Hh)富集區(qū)域，共有160處，α螺旋(Hh)含量達(dá)到55.17%；無規(guī)則卷曲(Cc)105處，占二級結(jié)構(gòu)的36.21%；β折疊(Ee)25處，占二級結(jié)構(gòu)的8.62%。犏牛TB-RBP蛋白α螺旋(Hh)46.11%，無規(guī)則卷曲(Cc)41.45%，α螺旋和無規(guī)則卷曲為主要組成結(jié)構(gòu)。

利用SWISS-MODEL查找與TB-RBP氨基酸序列相似性較高的序列預(yù)測其蛋白三級結(jié)構(gòu)，下載相應(yīng)的PDB模型，利用RasMol軟件對預(yù)測三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測分析(圖7)。結(jié)果表明，牦牛TB-RBP蛋白含有7個α-螺旋，為全α型，其結(jié)構(gòu)為平行的α-螺旋/7螺旋束；犏牛TB-RBP蛋白包含5個α-螺旋，2個無規(guī)則卷曲，其結(jié)構(gòu)為環(huán)繞結(jié)構(gòu)束。

圖7 牦牛和犏牛TB-RBP蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.7.2 功能結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 利用TMHMM預(yù)測發(fā)現(xiàn)牦牛TB-RBP無跨膜結(jié)構(gòu)。用TMPRED軟件分析發(fā)現(xiàn)牦牛TB-RBP包含2個具有較高可能性的跨膜區(qū)，但只是明顯的TM片段，不存在跨膜蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域；犏牛該蛋白也不存在跨膜區(qū)，僅在17-33位包含一個TM跨膜螺旋。在線工具SignalP 4.1 Server預(yù)測TB-RBP蛋白信號肽，結(jié)果表明，TB-RBP蛋白無信號肽序列，該蛋白為非分泌型蛋白。利用NetOGlyc 1.0、NetPhos 2.0分別對TB-RBP蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TB-RBP蛋白存在6個賴氨酸ε氨基糖基化位點(diǎn)(10，80，103，106，183，221)，15個磷酸化位點(diǎn)，分別為10個絲氨酸位點(diǎn)(9，21，51，83，86，97，109，110，147，207)、3個蘇氨酸位點(diǎn)(64，125，155)、2個酪氨酸位點(diǎn)(179，186)。

利用NCBI 中Conserved Domain Search Service(CD Search)預(yù)測TB-RBP蛋白保守結(jié)構(gòu)域(圖8)。結(jié)果表明，TB-RBP蛋白屬于Translin結(jié)合蛋白家族，其中Translin(TB-RBP)及其結(jié)合蛋白TRAX是一對旁系同源保守蛋白，TRAX和Translin的寡聚蛋白復(fù)合物形成C3PO(也稱RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC)，Translin-Trax復(fù)合物可增強(qiáng)RNAi中錯義鏈的去除和活性RISC的形成。除RNAi之外，Translin和Trax還參與多種核酸代謝途徑，并涉及廣泛的生物活性，包括mRNA加工、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、精子發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育、基因組穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和致癌作用等。

圖8 TB-RBP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果

2.7.3 蛋白質(zhì)功能分析 PSORT Ⅱ Prediction分析發(fā)現(xiàn)，TB-RBP基因編碼的蛋白分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、分泌系統(tǒng)的囊泡和細(xì)胞骨架，其中在細(xì)胞核中分布最多，達(dá)到60.9%，具有核定位信號的功能。

2.8 牦牛TB-RBP mRNA組織表達(dá)

2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 將標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋的5個濃度(10-3～10-12)作為模板，每個濃度做至少3個重復(fù)，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，由擴(kuò)增曲線得到Ct值，由軟件擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過SYBR GREEN 熒光定量PCR建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線(圖9)，TB-RBP基因相關(guān)系數(shù)為0.993，說明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性很好。標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值線性圖橫坐標(biāo)代表拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，TB-RBP標(biāo)準(zhǔn)曲線及其擴(kuò)增曲線，在10-2～10-6范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.224x+42.160。

2.8.2 熒光定量RT-PCR結(jié)果 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值，可對每一樣品初始拷貝數(shù)絕對定量。牦牛和犏牛睪丸組織每100 ng總RNA中，TB-RBP基因的拷貝數(shù)為4.95×105～7.75×108，TB-RBP基因在犏牛和牦牛的睪丸組織中均有表達(dá)；t檢驗(yàn)表明，TB-RBP基因的表達(dá)量在牦牛與犏牛組間差異顯著(0.01

Ct值與模板量拷貝數(shù)的對數(shù)值作圖標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)；以模板在不同循環(huán)擴(kuò)增時的熒光強(qiáng)度作圖擴(kuò)增曲線(B)。

圖中標(biāo)有不同字母者為差異顯著(小寫字母表示P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

目前，Translin蛋白在非洲爪蟾、小鼠、果蠅、人類等物種中均有發(fā)現(xiàn)[6]，是一種進(jìn)化保守且高度同源的蛋白，而TB-RBP是在小鼠睪丸和腦組織中發(fā)現(xiàn)的一種translin蛋白，TB-RBP蛋白在機(jī)體中的調(diào)控作用主要通過與DNA/RNA的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。在睪丸中，TB-RBP可調(diào)控減數(shù)分裂產(chǎn)生的生殖細(xì)胞mRNA的表達(dá)，同時對非編碼RNA轉(zhuǎn)錄也發(fā)揮重要作用[7]。目前，雄性生殖細(xì)胞中TB-RBP對miRNA也起到穩(wěn)定作用，而其作用機(jī)制尚不清楚[8]。犏牛作為牦牛和普通牛的雜交后代，其在役用性、抗病力及適應(yīng)性等方面均優(yōu)于親本個體，產(chǎn)肉量和產(chǎn)奶量較親本牦牛高，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢，但犏牛雄性不育和雜種優(yōu)勢是目前限制和影響牦牛遠(yuǎn)緣雜交改良工作深入開展的關(guān)鍵問題，因此如何利用現(xiàn)代分子技術(shù)破解動物種間雜種雄性不育機(jī)理，也成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域最富有挑戰(zhàn)意義的重大課題之一。本研究通過對與牦牛和犏牛精子發(fā)生相關(guān)基因的研究，初步驗(yàn)證候選基因在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá)情況。

3.1 TB-RBP基因生物學(xué)功能分析

通過對牦牛、犏牛TB-RBP基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，絲氨酸、亮氨酸、谷氨酸占比最大，且在15個磷酸化位點(diǎn)中包含10個絲氨酸位點(diǎn)。谷氨酸可參與動、植物及微生物代謝過程中多種重要化學(xué)反應(yīng)，同時也是一種重要的鮮味劑，相關(guān)研究顯示，犏牛在生長性狀及屠宰性狀均優(yōu)于牦牛，且具有高蛋白、低脂肪等特點(diǎn)，氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)含量豐富，雜種優(yōu)勢明顯[9-10]，這與其富含谷氨酸存在一定關(guān)聯(lián)。段鵬杰[11]研究發(fā)現(xiàn)，閹牛肉中谷氨酸和必需氨基酸含量均顯著高于對照組，說明在日糧中添加谷氨酸渣可以促進(jìn)肉牛生長。而精氨酸也可在一定程度上改善家畜胴體組成及肉質(zhì)性狀指標(biāo)，牦牛睪丸組織中絲氨酸和精氨酸含量較高，其中絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2能夠磷酸化富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子，可能參與小鼠精子發(fā)育成形過程中mRNA前體分子的剪接，是維持睪丸正常發(fā)育成形所必須[12-13]。絲氨酸作為肌肉和脂肪的重要組成成分，在其代謝及生長等過程均發(fā)揮重要作用[14-15]，且絲氨酸有助于機(jī)體中抗體和免疫血球素的產(chǎn)生，使免疫系統(tǒng)免受侵害維持其健康的免疫環(huán)境，本研究中牦牛和犏牛絲氨酸含量均較多，也從側(cè)面驗(yàn)證了牦牛及犏牛對高原惡劣生態(tài)環(huán)境的極強(qiáng)適應(yīng)性。TB-RBP屬不穩(wěn)定蛋白，作為轉(zhuǎn)位蛋白參與染色體易位等生物過程，容易與特異性mRNA結(jié)合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化介導(dǎo)不同的代謝過程。本試驗(yàn)中，該蛋白二級結(jié)構(gòu)存在多個α螺旋富集區(qū)，三級結(jié)構(gòu)為平行的α-螺旋/7螺旋束，說明α螺旋富集結(jié)構(gòu)對該蛋白發(fā)揮功能所必需。

3.2 犏牛、牦牛TB-RBP基因的表達(dá)水平

TB-RBP基因的表達(dá)量牦牛顯著高于犏牛(0.01

3.3 犏牛雄性不育機(jī)理

生殖隔離表現(xiàn)為兩方面：A種和B種的雜交繁殖變成困難或者不可能，而A種個體和B種個體在其種內(nèi)，則各自都能充分地進(jìn)行繁殖。在任何物種改變行為或生育器官結(jié)構(gòu)的突變都是可能發(fā)生的，但這種突變并不能產(chǎn)生有用的RI機(jī)制。造成RI的遺傳改變，不僅一定要避免突變類型和原始類型之間的繁殖，還要保證突變類型的正常繁殖。要是隔離包含著雜種不活性或雜種不育性，則這些效果必須限制在雜合體方面，而純合體不受影響。符合上述要求的突變，包括多基因突變系，染色體倍數(shù)變異、倒位、易位和細(xì)胞質(zhì)與核基因系的關(guān)系等。在有性和雜交受精的物種中要由單個突變步驟建立起熱核繁殖隔離機(jī)制是有很大困難的。因?yàn)橥蛔凅w第一次在群體中以雜合體而出現(xiàn)，不能生活和不育的雜合體總被消除掉，不論其相應(yīng)的純合體可能有多好的適應(yīng)性。產(chǎn)生隔離的突變型在起初的不利性，可因自體受精、單性生殖或無性生殖而得以減少。在成對的有性生殖和雜交受精的物種之間，RI一般是由有關(guān)物種所攜帶的互補(bǔ)基因復(fù)合體所造成的，要形成一個能夠起作用的隔離機(jī)制最少的基因數(shù)是2個，雜種不活和不育性是由互補(bǔ)基因或由呈顯性作用的遺傳條件所造成的，因而在雜合體就表現(xiàn)出來。Dobzhansky[18]認(rèn)為物種的基因型是一個適應(yīng)于該物種所生活的那個生態(tài)小境的完整系統(tǒng)，在種間雜種的后裔中，基因的重組合可能導(dǎo)致了不協(xié)調(diào)基因類型的形成，這就降低了2個雜交繁殖生物種的繁殖力。

犏牛雄性不育是種間生殖隔離的一種表現(xiàn)，是由長期自然選擇和基因突變不斷積累的結(jié)果，生物體任何性狀的改變均不是由單一基因位點(diǎn)突變決定的，而犏牛的生殖隔離也必定是多基因的產(chǎn)物。TB-RBP基因研究結(jié)果一定程度上支持鐘金城提出的犏牛雄性不育多基因假說[19]。同時，對精子發(fā)生相關(guān)基因的克隆，有助于揭示精子發(fā)生過程中相關(guān)基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，有助于對牦牛、普通牛及其雜種犏牛在睪丸和大腦組織中的基因組、特異基因的遺傳變異規(guī)律的研究，進(jìn)而從基因表達(dá)水平上闡明犏牛雄性不育的機(jī)理。