溫室黃瓜連作對(duì)土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響

李玉嬌，劉 星，吳大付，陳碧華，任秀娟，唐 蛟

(1.河南科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

設(shè)施蔬菜栽培是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分，能夠顯著提高自然資源利用效率，增加農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收益[1]。中國(guó)是全世界最大的設(shè)施蔬菜生產(chǎn)國(guó)，且種植規(guī)模仍以每年10%左右的速度增長(zhǎng)。2014 年全國(guó)設(shè)施蔬菜種植面積達(dá)到386×104hm2，產(chǎn)值超7 000億元，從業(yè)人員4 000萬(wàn)以上[2]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《全國(guó)設(shè)施蔬菜重點(diǎn)區(qū)域發(fā)展規(guī)劃(2015-2020年)》，到2020年，全國(guó)將新增設(shè)施蔬菜生產(chǎn)面積7.0×104hm2，總產(chǎn)值超過10 000億元，其收入占農(nóng)民人均純收入10%以上。在近年來(lái)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的大背景下，促進(jìn)設(shè)施蔬菜行業(yè)的提質(zhì)增效和健康發(fā)展對(duì)于解決三農(nóng)問題、促進(jìn)返鄉(xiāng)就業(yè)和實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興的戰(zhàn)略目標(biāo)具有重要意義。然而就整個(gè)設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)鏈而言，在生產(chǎn)環(huán)節(jié)由于長(zhǎng)期集約化種植所帶來(lái)的連作障礙問題依然是限制我國(guó)設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸之一[3]。因此，迫切需要闡明設(shè)施蔬菜連作障礙形成機(jī)理。

集約化設(shè)施蔬菜栽培呈現(xiàn)土壤耕作頻繁、復(fù)種指數(shù)高和水、肥供應(yīng)量大的顯著特點(diǎn)，菜農(nóng)受利益驅(qū)使，長(zhǎng)期連作種植導(dǎo)致土壤惡化、病蟲害猖獗、經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降等嚴(yán)重問題。健康的土壤環(huán)境是作物高產(chǎn)高效和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，盡管不同作物(品種)或地區(qū)之間的連作障礙機(jī)理可能存在差別，但主要源自土壤[4]。土壤是組分多樣化、具有高度異質(zhì)性和復(fù)雜性且易于擾動(dòng)的生態(tài)系統(tǒng)，長(zhǎng)期連作常常導(dǎo)致土壤性質(zhì)劣變，并對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)[5-6]，闡明設(shè)施蔬菜連作條件下土壤障礙因子(類型)是理清連作障礙機(jī)理并發(fā)展形成高效的連作土壤障礙因子消減技術(shù)的重要前提。早前的學(xué)者也從設(shè)施連作土壤理化和生化性質(zhì)變化角度得到了大量研究結(jié)論，諸如土壤物理結(jié)構(gòu)惡化(土壤板結(jié)和團(tuán)聚體穩(wěn)定性降低)、養(yǎng)分不均衡吸收和作物根區(qū)養(yǎng)分虧缺、土壤酸化和次生鹽漬化、土壤酶活性衰減、化感(自毒)作用、土傳致病菌滋生和根結(jié)線蟲富集等[7-8]。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，其在遺傳、結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的多樣性，有效驅(qū)動(dòng)著有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)、污染物降解和能量流動(dòng)等一系列土壤生物學(xué)過程，同時(shí)在抑制土傳病害和維持作物健康方面發(fā)揮重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，土壤微生物及其群落組成和結(jié)構(gòu)在連作種植條件下的行為變化特征越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。研究業(yè)已證明，長(zhǎng)期連作能夠顯著改變土壤中微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為降低土壤微生物多樣性，并隨著連作年限延長(zhǎng)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)顯著改變，從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，土傳病害顯著增加[9-15]。進(jìn)一步研究顯示，長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受到破壞，種間互作呈現(xiàn)無(wú)序和弱化的狀態(tài)，且有益微生物或具有潛在生防能力的微生物豐度降低，對(duì)土傳致病菌的競(jìng)爭(zhēng)能力下降[16-24]。然而，微生物受作物種類(品種)、土壤類型(質(zhì)地)、地理環(huán)境和氣候、耕作和栽培條件、養(yǎng)分供應(yīng)等各種因素影響較大，不同地區(qū)間土壤微生物種類、數(shù)量、多樣性和組成結(jié)構(gòu)等存在明顯差異，因而其對(duì)連作種植的響應(yīng)特征可能存在差別。豫北地區(qū)是河南省劃定的蔬菜種植產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢(shì)區(qū)，但區(qū)域內(nèi)設(shè)施蔬菜連作障礙的土壤微生態(tài)學(xué)機(jī)理迄今為止鮮有報(bào)道。鑒于此，以黃瓜這一傳統(tǒng)的設(shè)施蔬菜主栽作物為研究對(duì)象，通過采集具有不同黃瓜連作年限的土壤樣品，結(jié)合Real-time PCR和高通量測(cè)序等技術(shù)手段，研究了設(shè)施黃瓜連作對(duì)土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在為闡明區(qū)域內(nèi)設(shè)施蔬菜連作障礙機(jī)理和發(fā)展相關(guān)的連作土壤障礙因子消減技術(shù)提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

研究區(qū)域?yàn)楹幽鲜⌒锣l(xiāng)市牧野區(qū)朱莊屯村(地理坐標(biāo)35°21′12″ N，113°55′2″ E，平均海拔約56 m)，供試土壤為壤質(zhì)潮土。該區(qū)地處黃河中下游，屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季分明，雨熱同季，降水集中，年均氣溫14 ℃，全年無(wú)霜期220 d，年均降水量573.4 mm，水資源豐富，土層深厚，土壤肥沃。設(shè)施蔬菜方面，主要栽培黃瓜、番茄、辣椒和茄子等，種植結(jié)構(gòu)相對(duì)單一，且大多處于長(zhǎng)期連續(xù)種植狀態(tài)，連作障礙問題突出，枯萎病、黃萎病和青枯病等土傳病害較為普遍。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

在試驗(yàn)區(qū)內(nèi)選擇連作年限分別為1，5，10，15，20 a的黃瓜種植大棚各3個(gè)，用土鉆按五點(diǎn)取樣法在每個(gè)棚內(nèi)采集混合樣品1個(gè)，采樣深度為0～20 cm，即每個(gè)連作年限處理下共得到了相當(dāng)于3次重復(fù)的土壤樣本，5個(gè)連作年限處理分別用CC1、CC5、CC10、CC15和CC20表示。CC1地塊前茬作物為玉米，2017年春季開始轉(zhuǎn)為溫室黃瓜生產(chǎn)。土樣采集在2017年秋季黃瓜收獲時(shí)進(jìn)行，以盡可能排除植株根系和其他一些農(nóng)業(yè)管理措施對(duì)土壤樣本的潛在影響。將采集的新鮮土樣去除石塊、動(dòng)植物殘?bào)w等雜質(zhì)后，裝入干凈的密封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室過1 mm篩，將過篩后土壤分成3份，一份儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)用于后續(xù)的微生物分子生物學(xué)分析，一份在室溫下風(fēng)干用于測(cè)定土壤常規(guī)理化性質(zhì)，另一份立刻用于測(cè)定土壤礦質(zhì)氮含量和相關(guān)生化性質(zhì)。供試土壤理化和生化性質(zhì)測(cè)定方法見Liu等[25]的報(bào)道。為最大限度地消除不同地塊和年份間種植和管理措施對(duì)土壤取樣和后續(xù)數(shù)據(jù)分析的影響，本研究中所有溫室地塊均來(lái)自相同的農(nóng)民種植合作社，彼此相距較近，且一直采用當(dāng)?shù)亟y(tǒng)一的耕作種植和農(nóng)藝管理方法，具體細(xì)節(jié)見文獻(xiàn)[25]。

1.3 土壤真菌數(shù)量測(cè)定

按產(chǎn)品說明書上的步驟，使用PowerSoil DNA試劑盒提取微生物總DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測(cè)DNA的質(zhì)量和純度。將提取的DNA溶解在50 μL洗脫緩沖液中并于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。真菌PCR擴(kuò)增采用18S rRNA基因V5-V7區(qū)特異性通用引物對(duì)SSU0817F/1196R[26]。熒光定量PCR采用ABI 7500 實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行，每個(gè)土樣重復(fù)3次，擴(kuò)增體系(20 μL)如下： 10.0 μL ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(2×)，引物各0.8 μL(5 μmol/L)，2 μL DNA模板，6.4 μL ddH2O。擴(kuò)增條件為： 95 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)。在每一循環(huán)退火階段收集熒光，實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)并且記錄熒光信號(hào)變化，得出擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線。所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小為425 bp，通過熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增專一性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后并連接至pMD18-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的白色單克隆提取質(zhì)粒，測(cè)序確定插入DNA片段是否正確。采取10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，用10-2～10-7稀釋液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定閾值和基線，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為基因拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光定量PCR測(cè)得的Ct值。PCR擴(kuò)增效率93.96%，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2為0.999 4。通過Ct值，計(jì)算待測(cè)樣品中真菌數(shù)量，并進(jìn)一步計(jì)算各土壤樣品的真菌和細(xì)菌數(shù)量比值，細(xì)菌數(shù)量已在前期文獻(xiàn)中報(bào)道[25]，此處不再重復(fù)。

1.4 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)分析

采用高通量擴(kuò)增子測(cè)序方法(Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái))評(píng)估不同連作年限處理下土壤真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。以土壤微生物總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物對(duì)為SSU0817F/1196R[26]。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為： 4 μL FastPfu Buffer(5×)，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL Bovine serum albumin，引物各0.8 μL(5 μmol/L)，10 ng 模板DNA和11.2 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，采用Agarose Gel DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，并用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，最后將PCR產(chǎn)物等量混合，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

將高通量測(cè)序下機(jī)原始序列進(jìn)行雙端序列拼接和質(zhì)量過濾，使用QIIME軟件分析[27]。對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控，刪除尾部質(zhì)量值20以下、長(zhǎng)度小于200 bp的序列； 根據(jù)序列首尾兩端的標(biāo)簽和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，序列標(biāo)簽允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2，將序列分配至不同處理樣品；使用Uclust的方法按照97%的相似度進(jìn)行可操作分類單元(Operational taxonomic units OTU)聚類，每個(gè)OTU中數(shù)量最多的序列被挑選為代表序列；為得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)比對(duì)，以Silva 128/18S_Eukaryota數(shù)據(jù)庫(kù)為參考，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分類鑒定，分類置信度閾值為70%。本研究15個(gè)土壤樣本總計(jì)獲得642 481條高質(zhì)量序列，序列平均長(zhǎng)度為401 bp；對(duì)所得到的高質(zhì)量序列，按最小樣本序列數(shù)抽平(每個(gè)土壤樣本31 374條序列)，用于后續(xù)的α多樣性和β多樣性分析。根據(jù)OTU列表中各樣品物種豐度情況，應(yīng)用軟件MOTHUR計(jì)算菌群α多樣性指數(shù)。使用QIIME軟件，對(duì)Weighted的UniFrac距離矩陣進(jìn)行UPGMA聚類分析?；贐ray-curtis距離算法的主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis，PCoA)用于比較不同處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異，并利用相似度分析(Analysis of similarities，ANOSIM)檢驗(yàn)處理間真菌群落結(jié)構(gòu)的差異顯著性。對(duì)少數(shù)平均豐度較高且在Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中未能充分比對(duì)的OTU，在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行手工比對(duì)。通過Canoco 4.5軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)和真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算和圖表繪制在Microsoft Excel 2007和SigmaPlot 12.0軟件上進(jìn)行，使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理間差異的顯著性檢驗(yàn)(One-way，P< 0.05)。圖表中試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n= 3)。不同數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析采用常見的一元回歸模型進(jìn)行。真菌豐度采用常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換來(lái)表示。本研究所獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為SRP145523。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)施黃瓜連作對(duì)土壤真菌豐度和真細(xì)比的影響

溫室黃瓜連作顯著改變了土壤真菌數(shù)量(圖1)。較CC1相比，CC10和CC15真菌數(shù)量分別顯著增加4.42%和4.18%，但CC5和CC20處理均無(wú)顯著差異。各處理土壤真細(xì)比變化趨勢(shì)與真菌數(shù)量一致，CC10和CC15處理較CC1分別顯著增加3.45%和3.77%。同時(shí)，回歸分析證明土壤真菌數(shù)量和真細(xì)比均表現(xiàn)出隨連作年限延長(zhǎng)先增加后降低的拋物線趨勢(shì)(P< 0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表1-4同。

2.2 設(shè)施黃瓜連作對(duì)土壤真菌群落α多樣性和β多樣性的影響

由表1可知，CC5～CC20處理土壤真菌群落OTU數(shù)量和群落的Shannon、Simpson、Ace和Chao1指數(shù)總體上與CC1均無(wú)顯著差異，表明真菌群落的α多樣性并不受溫室黃瓜長(zhǎng)期連作影響。但從群落OTU組成上來(lái)看(圖2)，CC1～CC20各處理真菌群落共享的OTU數(shù)量為118個(gè)，獨(dú)有的OTU數(shù)量，5個(gè)處理依次為8，3，1，2，2個(gè)，分別占總觀測(cè)到OTU數(shù)量的5.52%，2.12%，0.73%，1.48%和1.31%，隨著溫室黃瓜連作年限延長(zhǎng)，群落中獨(dú)有的OTU比例降低，顯示溫室黃瓜連作改變了真菌群落組成。層級(jí)聚類(圖3-A)和PCoA分析(圖3-B)證明，溫室黃瓜連作顯著改變了真菌群落的β多樣性，且各連作年限處理間真菌群落結(jié)構(gòu)差異達(dá)到顯著水平。

表1 溫室黃瓜連作對(duì)土壤真菌群落α多樣性的影響

圖2 不同溫室黃瓜連作年限下土壤真菌群落共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目

2.3 設(shè)施黃瓜連作對(duì)土壤真菌群落成員的影響

真菌群落中平均相對(duì)豐度超過1%的真菌門分別為子囊菌門、未分類真菌(Unclassified_k_Fungi)、未分類真菌(Norank_k_Fungi)、擔(dān)子菌門、纖毛門和未分類真核生物(Unclassified_d_Eukaryota),這6個(gè)門共占總回收序列量的98.48%(表2)。其中，子囊菌門是所有供試土壤中最具優(yōu)勢(shì)的真菌門，其平均相對(duì)豐度占到總回收序列的87.22%，但各連作年限處理下子囊菌門的平均相對(duì)豐度并無(wú)顯著差異。與CC1相比，CC5～CC20處理?yè)?dān)子菌門平均相對(duì)豐度無(wú)顯著變化。CC20處理纖毛門平均相對(duì)豐度較CC1顯著增加302.20%，但CC5～CC15無(wú)顯著差異。

在目水平下，群落中平均相對(duì)豐度超過0.01%的真菌目共有18個(gè)，占總回收序列量的98.20%(表3)；平均相對(duì)豐度超過10%的真菌目共有4個(gè)，分別為小囊菌目、盤菌目、未分類子囊菌(Norank_p_Ascomycota)和糞殼菌目,占總回收序列量的70.05%。小囊菌目平均相對(duì)豐度在CC5～CC20下較CC1分別顯著增加159.35%，148.99%，85.20%和60.20%，且整體上隨連作年限延長(zhǎng)先增加后降低。溫室黃瓜連作顯著降低了未分類子囊菌平均相對(duì)豐度，CC5～CC20與CC1相比降幅分別達(dá)到54.62%，40.45%，55.46%和40.37%。糞殼菌目平均相對(duì)豐度表現(xiàn)出隨連作年限延長(zhǎng)先降低后增加的趨勢(shì)，CC5、CC10和CC15處理與CC1相比分別顯著降低59.05%，55.06%和30.27%，而CC20處理則顯著增加34.54%。與此同時(shí)，爪甲團(tuán)囊菌目、肉座菌目和Conthreep的平均相對(duì)豐度也均隨著連作年限延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著變化。

圖3 土壤真菌群落在OTU水平的層級(jí)聚類(A)和主成分分析(B)

表2 溫室黃瓜連作對(duì)門水平下土壤真菌群落成員平均相對(duì)豐度的影響

Tab.2 Effects of continuous cropping cucumber on average relative abundances of fungal community members at phylum level%

門Phylum平均相對(duì)豐度 Average relative abundanceCC1CC5CC10CC15CC20平均 Mean子囊菌門 Ascomycota87.32±4.32a89.36±0.48a86.79±1.56a86.69±1.38a85.97±2.75a87.22未分類真菌 Unclassified_k_Fungi4.15±2.52ab1.26±0.55c5.77±0.89a3.14±0.70bc1.80±0.23bc3.22未分類真菌 Norank_k_Fungi3.43±1.62a1.80±0.56b3.73±0.27a3.65±0.28a3.34±0.53a3.19擔(dān)子菌門 Basidiomycota1.78±0.99ab3.50±1.17a0.82±0.89b2.21±0.92ab1.11±1.27b1.88纖毛門 Ciliophora0.91±0.24b2.00±0.53b0.95±0.42b1.83±0.95b3.66±1.28a1.87未分類真核生物 Unclassified_d_Eukaryota0.76±0.20b1.12±0.11b0.87±0.14b1.10±0.26b1.59±0.33a1.09其他Others1.64±0.41b0.97±0.08b1.07±0.14b1.38±0.17b2.53±0.74a1.52

表3 溫室黃瓜連作對(duì)目水平下土壤真菌群落成員平均相對(duì)豐度的影響

在屬水平上，群落中最豐富的前20個(gè)真菌屬共占總回收序列量的96%左右(表4)。平均相對(duì)豐度超過10%的真菌屬有4個(gè)，分別為假埃希氏菌屬、Lasiobolidium、赭霉屬和毛殼菌屬，這4個(gè)屬共占總回收序列量的64.24%。假埃希氏菌屬平均相對(duì)豐度在CC1處理下最低，CC5～CC20處理較其分別顯著增加177.26%，159.57%，97.65%和65.16%，并在整體上表現(xiàn)出隨連作年限延長(zhǎng)先增加后降低的趨勢(shì)。Lasiobolidium平均相對(duì)豐度在各連作年限處理下無(wú)顯著變化。與CC1相比，溫室黃瓜連作年限增加顯著降低了赭霉屬的平均相對(duì)豐度。毛殼菌屬的平均相對(duì)豐度隨連作年限延長(zhǎng)先降低后增加，CC5、CC10和CC15處理與CC1相比分別顯著降低58.60%，56.25%和30.88%，而CC20顯著增加35.51%。CC5處理與CC1相比顯著降低了Gelatinomyce、Polychytrium和下梳霉屬的平均相對(duì)豐度,但顯著增加了帚枝霉屬和隱囊菌屬的平均相對(duì)豐度。CC15處理下小不整球殼屬平均相對(duì)豐度顯著高于其他處理。CC20處理下根生壺菌屬平均相對(duì)豐度顯著高于其他處理。CC10處理較CC1顯著增加了Arachniotus、糞盤菌屬、瓶毛殼屬和Rhodoveronaea的平均相對(duì)豐度。此外, 溫室生產(chǎn)中常見的2種土傳致病真菌絲核菌屬和鐮刀菌屬也被檢出, 但二者的平均相對(duì)豐度均較低(<1%)。不同連作年限處理下絲核菌屬平均相對(duì)豐度并無(wú)顯著差異。鐮刀菌屬平均相對(duì)豐度在CC15處理下最高, 但與CC1相比無(wú)顯著變化。

2.4 土壤理化性質(zhì)與真菌群落和群落成員的關(guān)系

豐度最高的前20個(gè)真菌屬中有12個(gè)與1個(gè)或多個(gè)土壤理化因子呈顯著或極顯著的線性相關(guān)關(guān)系(表5)。假埃希氏菌屬與有效磷和速效鉀呈顯著正相關(guān)； 赭霉屬與有機(jī)質(zhì)、有效磷和速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)； 小不整球殼屬與硝態(tài)氮呈極顯著正相關(guān)；Polychytrium、下梳霉屬和Rhodoveronaea與pH值呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；Sarocladium和Arachniotus分別于速效鉀和pH值呈顯著正相關(guān)；Rhizophydium與有機(jī)質(zhì)、有效磷和電導(dǎo)度呈顯著或極顯著正相關(guān)； 隱球菌屬與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)；絲核菌屬與速效鉀呈顯著正相關(guān)；Remersonia與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)。RDA分析表明(圖4)，土壤硝態(tài)氮(R2=0.721 2，P=0.001)、速效鉀(R2=0.699 8，P=0.002)和有機(jī)質(zhì)(R2=0.391 0，P=0.048)含量顯著驅(qū)動(dòng)著溫室黃瓜連作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)變化，其余土壤理化因子(全氮、銨態(tài)氮、速效磷、pH值和電導(dǎo)度)對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響并不顯著(P>0.05)。

表4 溫室黃瓜連作對(duì)最豐富的20個(gè)真菌屬的平均相對(duì)豐度的影響

表5 最豐富的20個(gè)真菌屬的平均相對(duì)豐度與土壤理化性質(zhì)的線性相關(guān)分析

注：ns.無(wú)顯著相關(guān)性；*.P<0.05；**.P<0.01。

Note： ns.No significant;*.P<0.05;**.P<0.01.

OM.有機(jī)質(zhì)；TN.全氮；AN.銨態(tài)氮；NN.硝態(tài)氮；AP.有效磷；AK.有效鉀；pH.酸堿度；EC.電導(dǎo)度。

OM，TN，AN，NN，AP，AK，pH and EC represent organic matter，total nitrogen，ammonium nitrogen，nitrate nitrogen，available phosphorus，available potassium，pH，and electrical conductance，respectively.

圖4 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子的關(guān)系(冗余分析)

Fig.4 The relationship of soil fungal community structureand soil physiochemical factors based on RDA analysis

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期集約化連作生產(chǎn)常常導(dǎo)致作物生長(zhǎng)發(fā)育受阻，經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和品質(zhì)降低，且土傳病害滋生，其中真菌型土傳病害表現(xiàn)尤為普遍[28-30]。大量基于可培養(yǎng)微生物和分子生物學(xué)方法進(jìn)行的研究報(bào)道業(yè)已證明，土壤微生物區(qū)系與土傳真菌型致病菌積累和病害發(fā)生息息相關(guān)[31-38]。因此，本研究將溫室黃瓜連作條件下土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)作為研究的重點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，溫室黃瓜連作顯著影響了土壤真菌數(shù)量，并表現(xiàn)出隨連作年限延長(zhǎng)先增加后降低的趨勢(shì)，這與Zhou等[14]的研究結(jié)果一致。真細(xì)比通常被認(rèn)為是表征土壤肥力和健康的重要指標(biāo)[39]，與真菌數(shù)量變化類似，真細(xì)比也隨連作年限延長(zhǎng)先增后減，顯示土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)受溫室黃瓜連作的顯著影響。值得注意的是，盡管早前較多的研究也證實(shí)長(zhǎng)期溫室連作常常增加土壤真菌數(shù)量并提高真細(xì)比[40-41]，但本研究結(jié)果暗示土壤真菌數(shù)量和微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)受連作年限長(zhǎng)短調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，一些作物的產(chǎn)量常常在一定連作年限后逐步得到自我恢復(fù)，并且連作障礙程度趨于減輕甚至消失，如大豆[42-43]和棉花[44-45]等，但其中相關(guān)的潛在機(jī)制尚不清晰，猜測(cè)可能與作物和土壤微生物二者在長(zhǎng)期連作種植過程中的相互適應(yīng)有關(guān)[45]。

高通量測(cè)序顯示，真菌群落的β多樣性與α多樣性相比對(duì)溫室黃瓜連作更為敏感。不同連作年限下土壤樣品真菌群落結(jié)構(gòu)明顯變化，在層級(jí)聚類分析和PCoA圖中，CC5～CC20處理土壤樣品與CC1區(qū)分明顯，這些與早前學(xué)者在溫室黃瓜連作研究中通過PCR-DGGE方法所取得的結(jié)果一致[13-14]。但Yao等[15]基于群落水平生理多樣性(CLPP)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)的方法研究表明，長(zhǎng)期溫室黃瓜連作顯著降低了土壤微生物多樣性，推測(cè)供試土壤性質(zhì)的不同以及方法學(xué)上的差異造成了這種不一致的研究結(jié)果。就真菌群落成員而言，少數(shù)的優(yōu)勢(shì)成員支配著整個(gè)真菌群落，假埃希氏菌屬、Lasiobolidium、赭霉屬和毛殼菌屬共占總回收序列量的64.24%，它們作為真菌群落組成的基石在最大程度上決定著整個(gè)真菌群落對(duì)溫室黃瓜連作的響應(yīng)。假埃希氏菌屬作為在屬水平下最豐富的群落成員，其平均相對(duì)豐度隨連作年限延長(zhǎng)先增后降，這與土壤真菌數(shù)量變化一致。高通量測(cè)序結(jié)果也證明不同真菌群落成員對(duì)溫室黃瓜連作響應(yīng)的差異性，這可能與土壤理化性質(zhì)變化有關(guān)，不同的微生物種屬適應(yīng)不同的生態(tài)位。相關(guān)分析的確證明，多數(shù)的優(yōu)勢(shì)真菌群落成員均與土壤理化因子之間存在著廣泛的相關(guān)性。

微生物常常行使各種各樣的土壤生態(tài)功能并能夠提供生態(tài)服務(wù)。假埃希氏菌屬是土壤N2O排放的重要貢獻(xiàn)者[46]，早前的研究也證明，自毒物質(zhì)(如香草醛)的添加能夠顯著降低黃瓜幼苗根際真菌群落中假埃希氏菌屬的平均相對(duì)豐度[47]。Lasiobolidium已被證明是設(shè)施番茄長(zhǎng)期連作土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌屬[48]，這與本研究結(jié)果類似。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，刨花楠(Machiluspauhoi)長(zhǎng)期種植顯著改變土壤優(yōu)勢(shì)真菌赭霉屬平均相對(duì)豐度[49]。毛殼菌是一種典型生防菌，可以產(chǎn)生抗生素和細(xì)胞壁降解酶，對(duì)一些土傳、氣傳病害起到防治作用[50]。在本試驗(yàn)中，CC5、CC10、CC15處理下毛殼菌平均相對(duì)豐度較CC1顯著降低，而在CC20處理下又顯著回升，表明土壤一些有益菌的豐度受連作年限影響，但連作20 a以后毛殼菌平均相對(duì)豐度出現(xiàn)顯著回升的內(nèi)在原因尚需進(jìn)一步研究。此類現(xiàn)象在東北地區(qū)大豆中也有所報(bào)道，魏巍[43]研究表明，長(zhǎng)期連作可形成根腐病抑制性土壤，減輕大豆根腐病發(fā)病程度，抑制病原鐮孢菌的生長(zhǎng)。另外，前人的研究結(jié)果表明，隨著連作年限的增加，土壤中致病性真菌增多。馬云華等[51]對(duì)溫室黃瓜的研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，土壤中引起黃瓜枯萎病的尖孢鐮刀菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)真菌生理群。本研究的結(jié)果顯示，土壤真菌群落中鐮刀菌(Fusariumsp.)的平均相對(duì)豐度較低，且CC5～CC20處理與CC1相比并未出現(xiàn)顯著差異；此外，另一種常見土傳致病菌絲核菌(Rhizoctoniasp.)的平均相對(duì)豐度在不同連作年限下也無(wú)顯著變化。推測(cè)可能與試驗(yàn)區(qū)內(nèi)菜農(nóng)長(zhǎng)期且高量的農(nóng)藥使用有關(guān)。有意思的是，盡管常見的土傳致病真菌的豐度并未發(fā)生明顯的改變，但是對(duì)細(xì)菌的高通量測(cè)序結(jié)果顯示，一些重要的生防菌芽孢桿菌(Bacillussp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.)的豐度隨連作年限延長(zhǎng)顯著降低。因此，需要進(jìn)一步闡明特征微生物在溫室蔬菜連作條件下的行為特征及其與土壤抑病性/致病性的關(guān)系。

本研究證明，硝態(tài)氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量是驅(qū)動(dòng)溫室黃瓜連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因子。前期的研究結(jié)果已經(jīng)證明[25]，長(zhǎng)期的溫室黃瓜連作顯著增加了土壤硝態(tài)氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)的含量。作為微生物的主要生境以及物質(zhì)和能源的供應(yīng)池，土壤環(huán)境變化直接驅(qū)動(dòng)微生物組成和結(jié)構(gòu)的變化，土壤微生物也對(duì)土壤理化因子擾動(dòng)做出快速響應(yīng)?？偟膩?lái)看，本研究結(jié)果也顯示了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)由長(zhǎng)期溫室黃瓜連作所導(dǎo)致的復(fù)雜的土壤理化環(huán)境變化的快速響應(yīng)。