基于Cas9-Free的擬南芥ALB3基因編輯載體構(gòu)建及驗證

馬銘賽，布梁灝，陳自銀，黃嘉玲，歐陽樂軍，李莉梅，王玉濤

(1.喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗室，新疆 喀什 844000；3.廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 茂名 525000)

植物葉色突變與光合作用密切相關(guān)，葉色突變體的獲得為研究植物的光合作用途徑以及生理代謝過程提供了關(guān)鍵材料[1]。ALB3即ALBINO3，可能參與葉綠體的生物發(fā)生，在植物的衰老過程中發(fā)揮重要作用。其編碼產(chǎn)物與植物葉綠體蛋白相關(guān)的細(xì)菌膜蛋白YidC以及酵母菌OXA1蛋白具有序列相似性，具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，位于葉綠體類囊體膜上，參與葉綠體酶復(fù)合體的組裝[2]。因此，ALB3的缺失可使擬南芥葉綠體發(fā)育異常，導(dǎo)致擬南芥葉片白化。

擬南芥ALB3突變體于1993年由Long等[3]首次得到，其利用玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Ac/Ds作為誘變劑，Ds的插入導(dǎo)致擬南芥產(chǎn)生白化現(xiàn)象，從而得到ALB3純合突變體，利用此種方法獲取突變體耗時且過程繁瑣，純合突變體幼苗生長在土壤中會致死，但當(dāng)培養(yǎng)在萌發(fā)培養(yǎng)基(GM培養(yǎng)基)時，ALB3純合突變體可以長出大約12片葉子，偶然會開花，但依舊不育[2]。隨后，證明ALB3是葉綠體分化重要的核基因，突變可導(dǎo)致類囊體不能正常發(fā)生[2]。近些年來，關(guān)于擬南芥ALB3的研究極少，這可能與難以獲得ALB3突變體且突變體容易致死有關(guān)，但是關(guān)于ALB3的研究相對較多，比如ALB3膜插入酶的C端可以聚集cpSRP43到類囊體膜[4]；擬南芥ALB3與亞碲酸鉀抗性C蛋白共同參與光系統(tǒng)Ⅱ蛋白合成[5]；擬南芥ALB3不需要保守的帶正電荷的殘基來功能性地補(bǔ)充大腸桿菌YidC消耗菌株或促進(jìn)YidC依賴性膜蛋白的插入[6]；植物和藻類葉綠素合成酶在集胞藻中起作用并可與YidC/Alb3膜插入酶相互作用[7]； ALB3轉(zhuǎn)位酶的基質(zhì)結(jié)構(gòu)域以高親和力結(jié)合并調(diào)節(jié)cpSRP54·cpFtsY復(fù)合物中的GTP水解等[8]。上述報道都為進(jìn)一步研究ALB3的功能奠定了基礎(chǔ)。

為了更高效地對擬南芥ALB3進(jìn)行定點(diǎn)編輯，建立一種更高效、安全的基因編輯體系，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建一種帶有紅色熒光蛋白基因mCherry且可敲除擬南芥ALB3的載體，利用可視化與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法快速篩選突變幼苗，大大節(jié)省了操作步驟，提高了工作效率，為快速獲取不含外源轉(zhuǎn)化元件的基因編輯后代提供借鑒與參考。

1 材料和方法

1.1 主要試驗材料

本試驗所用的帶有熒光篩選標(biāo)記基因mCherry的質(zhì)粒pHDE-mCherry由加州大學(xué)(圣地亞哥分校)Professor Zhao贈送，DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞分別購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司和上海維地生物技術(shù)有限公司，Col-0野生型擬南芥生長于廣東石油化工學(xué)院植物培養(yǎng)室。

1.2 主要試驗試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TaqDNA Polymerase(ET101)以及DNA Marker購于北京天根生化科技有限公司；卡那霉素和DNA Loading Buffer于上海生工生物工程股份有限公司購置，Epicentre T5 exonuclease、NEB Taq DNA Ligase、BsaⅠ限制性內(nèi)切酶以及NEB Phusion DNA polymerase均購于New England Biolabs公司(美國)，二硫蘇糖醇(DTT)購于北京碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 靶位點(diǎn)的設(shè)計

從NCBI上下載擬南芥ALB3基因序列(NC_003071.7)，并以此為目標(biāo)序列，通過CRISPR/Cas target在線設(shè)計網(wǎng)站(http：//crispr.dbcls.jp/)設(shè)計ALB3基因的2個Target位點(diǎn)，Target位點(diǎn)共包含23個堿基，形式如G-N19-NGG，第一個堿基G為小RNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，G-N19為插入載體的gRNA序列，NGG為PAM(Proto-spacer adjacent motif)序列，是Cas9基因的識別位點(diǎn)，即下劃線位置。Target1：5′-GTCCGTCACAGTGGAGTAGGAGG-3′；Target2：5′-CCTCTGCCGAGCAGCTATAGTGG-3′。

1.4 引物設(shè)計

試驗所用引物在Primer primer 5軟件上設(shè)計，由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成(表1)。

表1 試驗所用引物序列

1.5 pHDE-mCherry-ALB3表達(dá)載體的構(gòu)建

1.5.1ALB3sgRNA片段的擴(kuò)增 以pCBC質(zhì)粒(含gRNA)為模板，ALB3-F和ALB3-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min，35個循環(huán)(變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，總延伸72 ℃ 2 min，4 ℃ 保存。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢驗，然后將檢驗成功的PCR產(chǎn)物(目的條帶)用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.5.2 質(zhì)粒pHDE-mchenry的酶切及同源重組 用BasⅠ酶對pHDE-mCherry質(zhì)粒進(jìn)行酶切，20 μL體系，37 ℃反應(yīng)4 h，以未酶切質(zhì)粒為對照，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行驗證。

將1.5.1純化回收所得到的ALB3sgRNA片段與酶切產(chǎn)物進(jìn)行同源重組，4.5 μL體系(重組酶3 μL，酶切質(zhì)粒0.3 μL，ALB3sgRNA片段1.2 μL)，50 ℃水浴1 h。

1.5.3 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及菌液PCR鑒定 利用熱擊法將重組產(chǎn)物導(dǎo)入DH5感受態(tài)細(xì)胞，方法參照廣州鼎國生物技術(shù)有限公司DH5α感受態(tài)使用說明(產(chǎn)品編號MCC001)，將轉(zhuǎn)化后的DH5α感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基上(含卡那霉素)培養(yǎng)12 h，挑選單菌落并進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)程序同1.5.1。

1.5.4 重組質(zhì)粒pHDE-mCherry-ALB3的提取與陽性重組子鑒定 將菌液PCR鑒定結(jié)果為陽性的菌液在LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/mL卡那霉素，卡那霉素與LB液體培養(yǎng)基的體積比為1/1000)擴(kuò)大培養(yǎng)，并于37 ℃搖菌12 h，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，反應(yīng)條件同菌液PCR。

挑選質(zhì)量較好的陽性重組質(zhì)粒送至生工生物工程股份有限公司(廣州)測序，并用Mega 6.06軟件進(jìn)行序列比對驗證。

1.6 擬南芥的轉(zhuǎn)化

1.6.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及浸染液的配制 將測序成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法參照上海唯地生物技術(shù)有限公司說明書(產(chǎn)品編號AC1001)，將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌GV3103感受態(tài)細(xì)胞于LB固體培養(yǎng)基上(含卡那霉素和利福平)于28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)程序同1.5.1。

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，挑選條帶質(zhì)量最好的菌液于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素和利福平)中擴(kuò)繁培養(yǎng)，28 ℃搖菌16 h。收集菌體，重懸于100 mL浸染緩沖液(5%的蔗糖溶液，0.02%的Silwet L-77)中，浸染液即配制完成。

1.6.2 擬南芥的浸染 將Col-0野生型擬南芥種子進(jìn)行種植，出現(xiàn)花蕾后打頂，待側(cè)枝出現(xiàn)花蕾后，于浸染前1 d將所有開花的花朵以及莢果剪除。

用農(nóng)桿菌浸染液浸染花苞，輕輕攪動1～2 min后取出，將葉片以及莖上的殘留液體用吸水紙吸除，暗培養(yǎng)48 h后正常培養(yǎng)，待新一批花苞長出時再次浸染。

1.7 轉(zhuǎn)化后代的篩選與鑒定

1.7.1 轉(zhuǎn)化T0種子的可視化篩選 收取轉(zhuǎn)化后的擬南芥種子，命名為T0種子，利用倒置熒光顯微鏡在T0種子中篩選帶有紅色熒光的種子并種植，得到T1植株。

1.7.2 突變植株的篩選及鑒定 觀察T1植株的表型是否與野生型植株有所異同，并剪取T1植株(尤其是表型特殊的)幼嫩葉片，提取植株的DNA，以此為模板，利用ALB3-GT1和ALB3-GT2這對鑒定引物對目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min，35個循環(huán)(變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，總延伸72 ℃ 2 min，4 ℃ 保存。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對目的條帶的大小進(jìn)行驗證，確認(rèn)是否將目標(biāo)基因ALB3敲除成功。然后以Cas9-F和Cas9-R這對引物對已敲除ALB3的突變植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min，35個循環(huán)(變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s)，總延伸72 ℃ 2 min，4 ℃ 保存。驗證其是否攜帶外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白。

利用倒置熒光顯微鏡篩選T1種子中不帶熒光的種子進(jìn)行種植，并對其幼苗(T2幼苗)進(jìn)行ALB3敲除驗證以及是否攜帶外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白鑒定，方法同T1植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 pHDE-mCherry-ALB3表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

BsaⅠ酶切pHDE-mCherry質(zhì)粒(圖1-A)，酶切后因質(zhì)粒線性化，電泳遷移率慢于酶切前。經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因ALB3sgRNA(圖1-B)，條帶大小為500～750 bp，與預(yù)期擴(kuò)增長度592 bp相一致，切膠回收后可與酶切產(chǎn)物同源重組。

重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，菌液PCR結(jié)果(圖1-C)顯示，擴(kuò)增條帶大小為500～750 bp，與預(yù)期(592 bp)相符，且陽性率為100%。

挑選目的條帶質(zhì)量較好的菌液擴(kuò)繁培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定(圖1-D)，條帶大小符合預(yù)期，初步判定pHDE-mCherry-ALB3表達(dá)載體構(gòu)建成功。送樣測序后，通過序列比對(圖2)，進(jìn)一步確認(rèn)pHDE-mCherry-ALB3表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.ALB3sgRNA片段的PCR擴(kuò)增：M.DL2000 DNA Marker；B.BsaⅠ酶切pHDE-mCherry質(zhì)粒電泳結(jié)果: 1.未酶切的pHDE-mCherry質(zhì)粒;2.BsaⅠ酶切的pHDE-mCherry質(zhì)粒；C.pHDE-mCherry-ALB3重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定結(jié)果:M.DL2000 DNA Marker; 1-6.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液 PCR結(jié)果;7.陽性對照; 8.陰性對照；D.重組載體pHDE-mCherry-ALB3PCR鑒定結(jié)果:M.DL2000 DNA Marker;1.陽性對照; 2.陰性對照;3-7.重組質(zhì)粒pHDE-mCherry-ALB3PCR結(jié)果。

A.The PCR amplification result ofALB3sgRNA sequence:M.DL2000 DNA Marker; B.TheBsaⅠ digestion result of pHDE-mCherryplasmid: 1. Original pHDE-mCherryplasmid;2.pHDE-mCherryplasmid digested withBsaⅠ enzyme; C.The bacterial so lution PCR identification results of pHDE-mCherry-ALB3recombinant plasmid:M.DL2000 DNA Marker; 1-6. PCR result of recombinant plasmid transforming bacterial solution;7.Positive control; 8. Negative control; D.The PCR identification result of recombinant vector pHDE-mCherry-ALB3:M. DL2000 DNA Marker;1.Positive control; 2.Negative control;3-7. PCR result of recombinant plasmid pHDE-mCherry-ALB3.

圖1 pHDE-mCherry-ALB3表達(dá)載體的構(gòu)建

Fig.1 Construction of pHDE-mCherry-ALB3expression vector

圖2 序列比對結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pHDE-mCherry-ALB3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌結(jié)果

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3103感受態(tài)細(xì)胞后，為了驗證是否成功轉(zhuǎn)化，對其菌液進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果(圖3)顯示條帶大小在500～750 bp，符合預(yù)期大小，說明工程菌轉(zhuǎn)化成功。

M.DL2000 DNA Marker；1-6.重組質(zhì)粒pHDE-mCherry-ALB3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 PCR結(jié)果；7.陽性對照；8.陰性對照。

2.3 轉(zhuǎn)化后代的可視化篩選

2.3.1 陽性轉(zhuǎn)化種子篩選 本試驗所用表達(dá)載體中含有紅色熒光蛋白mCherry基因，成功轉(zhuǎn)化的種子在580 nm激發(fā)光的照射下可激發(fā)出紅色熒光(圖4)，沒有轉(zhuǎn)化成功的種子沒有熒光，極大地提高了陽性轉(zhuǎn)化后代的篩選效率。

圖4 倒置熒光顯微鏡下種子顯色情況

2.3.2 編輯后代的表型及分子鑒定結(jié)果 將篩選得到的紅色熒光種子種植在培養(yǎng)基上，萌發(fā)后觀察到一些幼苗的葉子極淡，為淺黃色(圖5)，將這些幼苗移植到土壤中生長一段時間，葉子顏色更淡，為白色(圖6)，表現(xiàn)為ALB3基因缺失的表型。

圖5 培養(yǎng)基中突變幼苗與野生幼苗生長情況

圖6 土壤中突變幼苗與野生幼苗生長情況

為驗證ALB3基因編輯情況，對上述白化植株進(jìn)行 PCR鑒定(圖7-A)。由于本試驗中對ALB3基因設(shè)計了2個編輯位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)大片段的敲除，在2個編輯位點(diǎn)上下游設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，野生型對照(泳道9)擴(kuò)增得到一個大片段，而泳道8擴(kuò)增片段大小明顯小于野生植株，為ALB3基因中間敲除后擴(kuò)增得到的小片段，即為純合突變，泳道1和5擴(kuò)增得到一大一小2個片段，表明這2個植株為雜合突變。對含紅色熒光種子的T1植株進(jìn)行外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白的檢驗(圖7-B)，均能擴(kuò)增得到Cas9基因片段，說明T1植株均含外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白。

A.T1突變體植株的基因敲除鑒定:M.DL1200 DNA Marker;1和5.T1雜合突變幼苗; 8.T1純合突變幼苗;2-4.T1未發(fā)生突變幼苗;9.野生幼苗(對照組); B.T1突變體植株的Cas9檢驗:M.DL1200 DNA Marker; 1-6.T1突變幼苗; 7.野生幼苗(對照組)。

A. Gene knockout identification of T1mutant plants:M. DL1200 DNA Marker; 1 and 5.T1generation homozygous mutant seedlings; 8.Heterozygote mutants in the T1generation；2-4. Mutants of T1generation without mutation;9.Wild seedlings (control group); B. Identification of T1generation mutant plants withCas9:M.DL1200 DNA Marker;1-6. T1generation mutant seedlings;7.Wild seedlings (control group).

圖7 T1突變體植株分子鑒定結(jié)果

Fig.7 Molecular identification results of T1mutant plants

對T2幼苗進(jìn)行ALB3敲除鑒定(圖8-A)和外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白檢驗(圖8-B)，發(fā)現(xiàn)純合突變幼苗都不含Cas9基因，由此成功獲得不含外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白的純合突變植株。但是突變植株經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，一直處于只有2片葉子的狀態(tài)，無法存活，這可能是ALB3基因的缺失引起的，需深入研究。

A. T2突變體植株的基因敲除鑒定:M.DL1200 DNA Marker;1.野生幼苗(對照組);2-3.T2未發(fā)生突變幼苗;4-7. T2純合突變幼苗; B. T2突變體植株的Cas9檢驗: M.DL1200 DNA Marker; 1-7.T2突變幼苗;8.野生幼苗(對照組)。

A.Gene knockout identification of T2mutant plants:M.DL1200 DNA Marker；1.Wild seedlings (control group)；2-3. Mutants of T2generation without mutation；4-7. T2generation homozygous mutant seedlings；B.Identification of T2generation mutant plants withCas9：M. DL1200 DNA Marker；1-7. T2generation mutant seedlings；8.Wild seedlings (control group).

圖8 T2突變體植株分子鑒定結(jié)果

Fig.8 Molecular identification results of T2mutant plants

3 討論

3.1 mCherry在篩選突變種子中的應(yīng)用優(yōu)勢

mCherry為一種紅色熒光蛋白基因，來自于蘑菇珊瑚(Mushroom coral)，所編碼的蛋白具有很強(qiáng)的光穩(wěn)定性[9]。本研究在所構(gòu)載體中引入mCherry，利用種皮特異性啟動子At2S3促使其表達(dá)，在熒光顯微鏡特定波長的激發(fā)下，應(yīng)用外源轉(zhuǎn)化元件中帶有熒光蛋白的標(biāo)記特性，篩選擬南芥轉(zhuǎn)化初期帶有熒光的種子，實(shí)現(xiàn)對突變體的可視化篩選，提高獲得轉(zhuǎn)化后代陽性植株比例，提高篩選效率。這種通過可視化熒光篩選標(biāo)記來判斷種子中是否含有CRISPR/Cas9表達(dá)系統(tǒng)的方法簡單易行，準(zhǔn)確性高，對基因編輯事件的檢測在經(jīng)過可視化篩選后只需要進(jìn)行簡單的PCR驗證，即可確定是否獲得Cas9-Free的突變后代，極大地提高了工作效率，為有性繁殖作物基因編輯后代中獲得新種質(zhì)資源提供了一種全新的技術(shù)方法，具有一定的創(chuàng)新性。

3.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢

CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種有效的基因編輯工具，具有操作簡單、高效性和特異性等其他基因編輯工具不可比擬的優(yōu)勢[10-14]。利用TALEN和CRISPR/Cas9 2種基因編輯技術(shù)分別對同一種基因進(jìn)行改造，效率分別為0～34%，51%～79%，充分證明了CRISPR/Cas9技術(shù)的高效性，且相較于前者，CRISPR/Cas9技術(shù)操作簡單[15]。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已在大豆[16]、水稻[17-18]、亞麻[19]、伴礦景天[20]、木薯[21]、甘藍(lán)[22]等植物中實(shí)現(xiàn)了基因編輯，應(yīng)用廣泛，為植物特定基因的功能探究以及新種質(zhì)資源的創(chuàng)建提供了技術(shù)參考。

本研究設(shè)計2個sgRNA，使其同時識別靶基因ALB3的2個不同位點(diǎn)，構(gòu)建一種帶有熒光篩選標(biāo)記且可實(shí)現(xiàn)靶基因敲除的基因編輯體系。通過轉(zhuǎn)化擬南芥，挑選轉(zhuǎn)化后種皮上帶有紅色熒光標(biāo)記的T0陽性種子進(jìn)行種植，得到T1幼苗，經(jīng)觀察植株表型以及PCR鑒定得到純合突變幼苗，但此時純合突變幼苗存在Cas9表達(dá)核且會致死，為了得到不攜帶Cas9表達(dá)核的純合突變體，需進(jìn)一步挑選T1植株中不帶熒光的種子進(jìn)行培育，得到的T2幼苗，經(jīng)表型觀察以及PCR鑒定，得到純合突變幼苗，利用PCR技術(shù)對Cas9基因進(jìn)行檢測，Cas9基因已去除，說明外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白已隨著配子產(chǎn)生過程中染色體的分離而去除，由此得到無Cas9蛋白外源轉(zhuǎn)化元件的純合突變體幼苗，可穩(wěn)定遺傳。本技術(shù)成功分離出外源轉(zhuǎn)化元件Cas9蛋白，獲得可穩(wěn)定遺傳的純合突變體。為探索ALB3在光合作用中的作用提供了理想材料，并為研究ALB3在植物生長發(fā)育的作用以及新種質(zhì)資源的建立奠定了基礎(chǔ)。