一株人血源豬鏈球菌的分子分型與耐藥檢測

呂燕寧 彭曉旻 趙佳琛 劉醫(yī)萌 陳麗娟

豬鏈球菌(Streptococcus suis)是呈世界性分布的可以感染豬和人,而引起疾病的一種人獸共患病病原體。 根據(jù)其莢膜抗原的特異性,可分為35 個(gè)血清型,即1 ～34 型和1/2 型(同時(shí)含有1 型和2 型抗原),能感染人的致病血清型主要包括1、2、1/2、7、9 和14 型等6 種。 其中毒力最強(qiáng)的是1 型,而2 型分布最廣泛,是引起我國豬鏈球菌病疫情的主要流行株,不僅能引起大規(guī)模的動物疫情,還可引起人偶發(fā)病例甚至造成人間疫情的暴發(fā),嚴(yán)重者致人死亡,對公眾健康尤其是高危人群的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。 20 世紀(jì)90 年代末和21 世紀(jì)初,江蘇省和四川省曾發(fā)生過大規(guī)模人感染豬鏈球菌病疫情,導(dǎo)致多人死亡[1,2],近年人感染豬鏈球菌病散發(fā)病例在其他省份也時(shí)有發(fā)生[3-5]。 因此對該致病菌的快速鑒定分型以及耐藥分析可以為患者的有效治療和感染溯源以及突發(fā)疫情的迅速處置提供依據(jù)。 根據(jù)以往的監(jiān)測數(shù)據(jù),北京市既往無本地病例發(fā)生,本研究對北京市某醫(yī)院就診的1 例來自河北省人感染豬鏈球菌病例的血培養(yǎng)分離株,進(jìn)行了分子分型與耐藥分析,此病例為北京市首例實(shí)驗(yàn)室確診的輸入病例。 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例信息 患者,男,52 歲,來自河北省廊坊市,于2015 年12 月11 日發(fā)病,就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院,病情加重后于13 日轉(zhuǎn)至北京協(xié)和醫(yī)院急診科,主要癥狀有意識障礙、呼之不應(yīng)、譫妄和躁動不安,伴有發(fā)熱、惡心、嘔吐及二便失禁。 患者在工作單位負(fù)責(zé)豬、牛、羊、驢、雞和`鴨的飼養(yǎng)工作,其住所臨近豬舍。 近年其工作場所均有病死豬情況發(fā)生,發(fā)病前一周,患者接觸過1 只病死豬,對病死豬去毛時(shí),手部有傷口。 臨床診斷為人感染豬鏈球菌病、化膿性腦膜炎和急性腦梗死。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 哥倫比亞血瓊脂平板(英國OXOID公司),PCR 試劑為Invitrogen Platinum PCR SuperMix(美國Thermo 公司),革蘭氏陽性菌藥敏檢測板K-1 型及配套試劑(上海星佰生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 iCycler PCR 儀(美國伯樂公司),毛細(xì)管核酸電泳儀QIAXCEL(德國QIAGEN 公司),全自動藥敏試驗(yàn)菌液接種儀(美國Thermo 公司)。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將血培養(yǎng)物取200 μL 接種于哥倫比亞血瓊脂平板劃線培養(yǎng),置37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 選取血平板上微小、圓形、邊緣整齊、略帶灰白色、露滴樣、有明顯的α 型或β 型溶血的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡檢查呈成對或短鏈狀革蘭氏陽性球菌。 挑取單菌落再接種到血瓊脂平板上,置37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 ～48 h,獲得分離菌的純培養(yǎng)物。

1.5 細(xì)菌鑒定 染色鏡檢、血清分型試驗(yàn)、篩檢生化試驗(yàn)參見文獻(xiàn)[6]。

1.6 多位點(diǎn)序列分型(MLST)檢測

1.6.1 菌株DNA 制備: 刮取1 ～2 接種環(huán)菌苔加入150 μL 三蒸水中,振蕩混勻制成菌懸液,100 ℃煮沸10 min;14 500 r/min 離心10 min,取上清液于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 目的片段擴(kuò)增及序列分析: 根據(jù)MLST 數(shù)據(jù)庫(https:/ /pubmlst.org/ssuis/)和文獻(xiàn)報(bào)道[7,8],對豬鏈球菌7 個(gè)管家基因(aroA,dpr,cpn60,gki,mutS,recA,thrA)進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列見表1。 反應(yīng)體系為:21 μL Invitrogen Platinum PCR SuperMix, 上下游引物各1 μL,DNA 模板2 μL,共25 μL。 反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 4 min,變性95℃ 30 s,退火30 s,退火溫度參見表1,延伸72℃ 30 s,30 個(gè)循環(huán),后續(xù)延伸72 ℃7 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳儀電泳分析后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。 雙向測序后經(jīng)過組裝分析確認(rèn)的序列, 在線遞交到豬鏈球菌MLST 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(https:/ /pubmlst. org/ssuis/)進(jìn)行分析。

1.7 藥敏試驗(yàn)(96 孔板微量稀釋法)

1.7.1 菌液制備: 用滅菌拭子取適量在血平板培養(yǎng)18 ～24 h 的新鮮純菌至滅菌生理鹽水中制成菌懸液,用比濁儀測定菌懸液濃度,使其達(dá)到0.5 麥?zhǔn)蠁挝弧?同時(shí),用ATCC29212 作為試驗(yàn)質(zhì)控菌株。

1.7.2 菌液稀釋和加樣: 取上述菌懸液 60 μL,加到12 mL 含 600 μL 無菌馬血清營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中,充分混勻。 取該肉湯培養(yǎng)液按照100 μL /孔量加入革蘭氏陽性需氧菌藥敏檢測96 孔板各孔中(陰性對照孔除外)。 該藥敏板中12 種抗生素(左氧沙星、青霉素、美羅培南、利奈唑胺、紅霉素、克林霉素、氯霉素、氧氟沙星、萬古霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟和頭孢吡肟)以不同濃度梯度分布。 質(zhì)控菌株操作同待測菌。

表1 豬鏈球菌7 個(gè)管家基因檢測引物及其產(chǎn)物大小

1.7.3 藥敏板培養(yǎng)和結(jié)果判讀: 加入菌懸液的藥敏板放37 ℃、5%CO2的溫箱中孵育24 h。 用微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)或肉眼判讀的方法對藥敏板條進(jìn)行讀數(shù),經(jīng)數(shù)據(jù)分析得到最低抑菌濃度(minium inhibitory concentration,MIC)值,根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)的M100ED29-2019 版的藥物折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果,獲得相應(yīng)的敏感(susceptible,S)、中介(intermediate,I)和耐藥(resistant,R)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果 分離菌株為革蘭氏陽性鏈球菌,觸酶試驗(yàn)陽性,血清分型試驗(yàn)與豬鏈球菌2 型血清凝集。

2.2 MLST 分型結(jié)果 經(jīng)PCR 反應(yīng)分別擴(kuò)增菌株基因組上的7 個(gè)管家基因位點(diǎn)aroA、dpr、cpn60、gki、mutS、recA 和thrA 的目標(biāo)片段,均獲得了清晰而又單一的目標(biāo)條帶(圖1)。 各基因測序結(jié)果在線遞交到豬鏈球菌MLST 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(https:/ /pubmlst. org/ssuis/)進(jìn)行等位基因的比對分析,得到基因型為ST1型(1-1-1-1-1-1-1)。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 在12 種抗生素中,該豬鏈球菌分離株僅對四環(huán)素和氯霉素耐藥,對左氧沙星、青霉素、美羅培南、利奈唑胺、紅霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢噻肟和頭孢吡肟均敏感,而對氧氟沙星為中度敏感(表2)。

3 討論

圖1 分離菌株7 個(gè)管家基因片段PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表2 抗菌藥物的判定折點(diǎn)與對分離菌株的最小抑菌濃度

3.1 豬鏈球菌具有復(fù)雜的遺傳多樣性,血清分型和分子分型是區(qū)別分離株和考查其致病性最重要的方法。 MLST 方法易于標(biāo)準(zhǔn)化,便于實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比對和分析,通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)共享,進(jìn)行全球范圍的流行病學(xué)分析。 豬鏈球菌MLST 分型方法最初由King 等[8]于2002 年建立,并對294 株豬鏈球菌分離株進(jìn)行分析,獲得了92 個(gè)序列型(ST):其中ST1 克隆群(12 個(gè)ST 型)、ST27 克隆群(11 個(gè)ST 型)和ST87 克隆群(11個(gè)ST 型)是最主要的ST 分組,包含了絕大多數(shù)的高致病性分離株。 ST1 群多來自腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和敗血癥的樣本,ST27 和ST87 群則主要來自肺臟,與臨床背景具有良好的相關(guān)性。 此后豬鏈球菌MLST 數(shù)據(jù)庫不斷豐富,到目前為止已發(fā)現(xiàn)了1 227 種ST 型。 本研究結(jié)果顯示,此次引起人感染的豬鏈球菌血清2 型ST1型菌株,為高致病性世界流行株,歐洲(英國、法國、西班牙、荷蘭、丹麥)、北美(美國、加拿大)、東南亞(泰國、越南)及中國(云南、四川、廣東、江蘇)均有報(bào)道[2,8-12]。 我國人感染豬鏈球菌分離株以ST1 和ST7型為主,ST1 與ST7 型同屬ST1 克隆群,兩者僅在thrA基因存在差異,而ST1 克隆群又被認(rèn)為是毒力最強(qiáng)、最具致病性的克隆群。 我國遼寧、江蘇、浙江、四川、湖南、云南、廣東和廣西等8 個(gè)省份有過ST1 型的報(bào)道,四川、浙江、江西、廣東和貴州等5 個(gè)省份有過ST7型的報(bào)道。 其中,四川以ST7 型為主,廣東和廣西均有發(fā)現(xiàn)ST1 與ST7 型,ST1 型略多。 血清2 型ST7 型與1998 年江蘇省和2005 年四川省的大規(guī)模暴發(fā)相關(guān),但之后未見大面積擴(kuò)散[13],ST1 型以散發(fā)為主。

3.2 豬鏈球菌耐藥情況,呈逐年加重趨勢[14]。 尤其是對四環(huán)素類藥,耐藥率可高達(dá)98.2%[15]。 針對人源分離株的耐藥檢測報(bào)道較少,此病例為河北省首例人感染豬鏈球菌病例[16,17],因此對分離株進(jìn)行耐藥檢測不僅對該患者的臨床治療有重要意義,也可以在一定程度上反映該地區(qū)豬鏈球菌的耐藥情況,為后續(xù)可能出現(xiàn)的續(xù)發(fā)病例能得到及時(shí)有效治療提供一定的提示。 耐藥檢測顯示此分離株僅對四環(huán)素和氯霉素耐藥,這與全國大部分地區(qū)的檢測結(jié)果一致[18-20],而與某些耐藥監(jiān)測結(jié)果不同的是[21],該分離株對其他9種常用抗生素仍是敏感的,可以做為臨床治療的備選藥。

本病例來自河北廊坊,距離北京很近,既往河北省和北京市未有過人感染豬鏈球菌病的病例報(bào)道,因此該病例作為人感染豬鏈球菌病的首發(fā)病例具有指示作用,提示河北省與北京市應(yīng)加強(qiáng)豬鏈球菌感染在豬間及人間流行病學(xué)與病原學(xué)的監(jiān)測。