結(jié)締組織生長(zhǎng)因子基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)系的研究

侯 雨，于 揚(yáng)，楊曉輝，于 勤，鄧春穎

糖尿病是以慢性高血糖為特征的一組代謝性疾病。其流行趨勢(shì)異常嚴(yán)峻，全球糖尿病發(fā)病呈整體上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，截至2013年全球共有3.82億人患有糖尿病，預(yù)計(jì)25年后糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到5.92億，發(fā)展中國(guó)家面臨的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，全球總患病人數(shù)的80.0%在發(fā)展中國(guó)家。而糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是其嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，也是成年人最主要的致盲眼病，有資料[2]顯示中國(guó)大陸糖尿病病人OR患病率為23%。DR發(fā)病機(jī)制未明，其病因可能與炎癥、組織缺血缺氧、氧化應(yīng)激、多元醇途徑亢進(jìn)、細(xì)胞增殖異常以及纖維化有關(guān)[3]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，被認(rèn)為是TGF-β1的直接下游效應(yīng)介質(zhì),可誘導(dǎo)下游的Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的合成，可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，進(jìn)而導(dǎo)致組織纖維化。血清中CTGF水平異常與DR相關(guān)性已經(jīng)得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析DR病人CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與DR的聯(lián)系?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 參照1999年WHO對(duì)糖尿病的診斷與分型，選取2014年6月至2015年5月大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的糖尿病病人120例，行眼底檢查，糖尿病病人行眼底熒光造影，根據(jù)2002年DR國(guó)際臨床分型統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，確診其中DR組(DR組)57例，男30例，女27例，年齡(57.26±7.97)歲，病程(8.11±3.79)年；糖尿病不合并視網(wǎng)膜病變組(NDR組)63例，男31例，女32例，年齡(59.25±8.17)歲，病程(7.74±3.27)年；健康對(duì)照組(NC組)為來(lái)院健康體檢者，共計(jì)58名，其中男27名，女31名，年齡(58.74±7.77)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對(duì)象均排除糖尿病急性并發(fā)癥、1型糖尿病、繼發(fā)性糖尿病及妊娠糖尿病；排除急慢性感染、嚴(yán)重肝臟疾病、腎病綜合征、高血壓腎病、腎小球腎炎等腎臟疾病(糖尿病腎病可入組)、腫瘤以及自身免疫性疾病、其他可引起組織纖維化的疾病；排除其他疾病引起的視網(wǎng)膜病變；NC組排除糖耐量異常與空腹血糖受損。3組一般資料均具有可比性。本研究通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 采取調(diào)查問(wèn)卷、查閱病例、體格檢查的方式獲取一般臨床資料。研究對(duì)象禁食禁飲8 h后采集標(biāo)本。

1.2.1 目的基因獲取以及甲基化 采集研究對(duì)象靜脈血2 mL，嚴(yán)格按照試劑盒(Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))要求提取DNA 50 μL，取目的基因20 μL，嚴(yán)格按照甲基化試劑盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，美國(guó)ZOMY RESEARCH)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA甲基化，獲取甲基化產(chǎn)物10 μL，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 MSPCR檢測(cè)目的基因甲基化水平 經(jīng)查Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)以及檢索相關(guān)文獻(xiàn)[4]，確定CTGF甲基化引物(M)以及非甲基化引物(U)，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成CTGF(M)上游引物5′-TCG TTT CGG TCG ATA GTT TC-3′；下游引物5′-CGA AAC CCA TAC TAA CGA CG-3′；CTGF(U)上游引物5′TTG TTT TGG TTG ATA GTT TT-3′下游引物5′-CAA AAC CCA TAC TAA CAA CA-3′ ；其產(chǎn)物長(zhǎng)度均為159 bp，嚴(yán)格按照Taq聚合酶擴(kuò)增試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))說(shuō)明書(shū)操作，擴(kuò)增體系為50 μL，其中亞硫酸氫鈉修飾DNA 1 μL，上下游M或者U引物各1 μL，RCR master 22 μL，dH2O 25 μL，甲基化與非甲基化反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物10 μL用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。如果甲基化條帶與非甲基化條帶同時(shí)出現(xiàn)，判定為半甲基化；出現(xiàn)甲基化條帶，無(wú)非甲基化條帶出現(xiàn)，判定為甲基化；出現(xiàn)非甲基化條帶而無(wú)甲基化條帶出現(xiàn)，判定為去甲基化。

1.2.3 血清中CTGF蛋白檢測(cè) 采集標(biāo)本2 mL，EDTA抗凝，2 500 r/min離心5 min，吸取血清，置于1.5 mL離心管中，濃度測(cè)定采取ELISA法測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn))說(shuō)明書(shū)操作，應(yīng)用酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)定吸光度值及讀出對(duì)應(yīng)濃度數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值計(jì)算出標(biāo)本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 甲基化陽(yáng)性率的判定 MSP凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 CTGF基因啟動(dòng)子甲基化MSPCR結(jié)果 DR組CTGF基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為24.45%低于NDR組的42.86%和NC組的78.95%(P<0.05和P<0.01)；NDR組甲基化陽(yáng)性率低于NC組的陽(yáng)性率(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 各組CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的比較[n；百分率(%)]

分組n甲基化狀態(tài)χ2PDR組5714(24.45) NDR組NC組635827(42.86)? 45(78.95)??△△33.53<0.01合計(jì)17886(48.31)

χ2分割：與DR組比較*P<0.05,**P<0.01；與NDR組比較△△P<0.01

2.3 各組血清中CTGF含量的比較 DR組血清CTGF水平高于NDR組和NC組(P<0.01)；NDR組血清CTGF水平高于NC組(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 各組CTGF測(cè)定值的比較

q檢驗(yàn)：與DR組比較**P<0.01；與NDR組比較△△P<0.01

3 討論

DR是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，已經(jīng)有資料[5]顯示CTGF與DR有關(guān)。CTGF是由BRADHAM等[6]于1991年在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的一種分泌性蛋白，廣泛分布于心、腦、肝、腎、肺、玻璃體、動(dòng)脈等多種組織器官中。CTGF作用較為廣泛，可以刺激并且誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)而導(dǎo)致器官或者組織纖維化，同時(shí)也可以刺激毛細(xì)血管形成并且可以促使細(xì)胞外基質(zhì)沉淀的同時(shí)重塑細(xì)胞外基質(zhì)[7-8]；另外還可以介導(dǎo)細(xì)胞黏附，刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[9]。作為纖維化介質(zhì)，CTGF的存在有著重大意義，在正常條件下，CTGF表達(dá)很低，但是在應(yīng)激、創(chuàng)傷、急性炎癥等條件下，CTGF表達(dá)可上調(diào)，在損傷修復(fù)以及瘢痕形成中發(fā)揮重大作用，利于創(chuàng)面愈合，利于機(jī)體修復(fù)。而機(jī)體損傷修復(fù)后，CTGF含量可下調(diào)至正常。糖尿病病人因?yàn)槲⒀h(huán)障礙導(dǎo)致組織缺血缺氧，導(dǎo)致血液中血小板及巨噬細(xì)胞活化從而導(dǎo)致TGF-β1大量的釋放，TGF-β1是CTGF的上游因子，其上調(diào)導(dǎo)致了CTGF含量的上調(diào)，CTGF不但可以促使視網(wǎng)膜中毛細(xì)血管的生成[10]，同時(shí)可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多以及纖維化[11]，由于CTGF含量上調(diào)，早期可導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜增厚，微血管瘤形成，進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)血管閉塞，視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血缺氧加重，由于視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血缺氧，進(jìn)一步導(dǎo)致新生毛細(xì)血管以及纖維組織的生成，隨著纖維組織的大量生成，逐漸牽拉視網(wǎng)膜，導(dǎo)致視網(wǎng)膜被撕脫，最終致使病人失明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血清中CTGF水平，DR組高于NDR組與NC組，提示血清中水平與DR相關(guān)，CTGF在DR形成中起一定作用：CTGF可促進(jìn)纖維化和毛細(xì)血管生成，CTGF的過(guò)表達(dá)與分泌可能是DR發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制。

已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)[12]證實(shí)了高血糖與DR發(fā)生具有密切相關(guān)性，但是英國(guó)前瞻性糖尿病研究以及后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人血糖控制良好之后，其視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率仍高于對(duì)照組。其機(jī)制可能與代謝記憶現(xiàn)象有關(guān)。目前對(duì)代謝記憶現(xiàn)象的機(jī)制尚未明確，代謝記憶效應(yīng)可能與表觀遺傳學(xué)有關(guān)。長(zhǎng)期慢性高糖血癥可引起血管病變包括大血管病變以及微血管病變，其共同機(jī)制為高血糖以及終末糖基化產(chǎn)物(AGEs)的增加使活性氧簇(ROS)的水平增加，從而使包括酪氨酸激酶(TK)、蛋白激酶C、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)等多條細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。這些通路的激活可以使NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活化，同時(shí)也使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)與DNA去甲基化酶(DeMet)的水平紊亂，這些都可以導(dǎo)致異常的甲基化，而 DNA 甲基化可通過(guò)影響染色體結(jié)構(gòu)和功能在基因表達(dá)的調(diào)節(jié)上起重要作用[13-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DR組甲基化陽(yáng)性率明顯低于NDR組與NC組，CTGF甲基化水平與血清CTGF水平呈負(fù)相關(guān)；CTGF基因啟動(dòng)子去甲基化導(dǎo)致DR與糖尿病腎病相一致，提示二者可能在分子機(jī)制上有相似性。

綜上，高血糖導(dǎo)致組織缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致血液中血小板及巨噬細(xì)胞活化從而導(dǎo)致TGF-β1大量的釋放，TGF-β1是CTGF的上游因子，其上調(diào)導(dǎo)致了CTGF含量的上調(diào)；而長(zhǎng)期高血糖以及AGEs堆積可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些通路的活化不但導(dǎo)致了核轉(zhuǎn)錄因子的激活，也導(dǎo)致甲基化酶水平的紊亂。這些都可以導(dǎo)致CTGF基因啟動(dòng)子甲基化水平減低，高甲基化水平抑制目的基因表達(dá)，這種抑制解除之后致使基因表達(dá)增強(qiáng)，最終導(dǎo)致血清CTGF含量增多，而CTGF具有刺激毛細(xì)血管增殖、刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及促使細(xì)胞外基質(zhì)增生的作用，這些都可以引起組織纖維化，隨著病情的進(jìn)展而導(dǎo)致DR的發(fā)生。從表觀遺傳學(xué)角度，CTGF基因啟動(dòng)子低甲基化導(dǎo)致血清CTGF水平升高，可能是DR發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)一定程度上闡述了CTGF基因啟動(dòng)子甲基化與DR的關(guān)系，但因?yàn)镃TGF功能眾多，高血糖導(dǎo)致CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具體機(jī)制有待更進(jìn)一步闡明；由于本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間限制收集標(biāo)本量少，且未將DR組標(biāo)本具體分為背景期組與增殖期組，NC組因志愿者配合問(wèn)題和醫(yī)學(xué)倫理等原因均未能行眼底熒光造影檢查，僅行眼底鏡檢查。在下一步實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)盡可能多地招募志愿者，并將DR組分為非增殖期DR組(NPDR組)與增殖期DR組(PDR組)，并結(jié)合檢測(cè)房水CTGF水平，重點(diǎn)探討CTGF基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與增殖期DR的關(guān)系；檢測(cè)TGF-β1、TSP1等相關(guān)因子的水平，探討DR病人CTGF基因啟動(dòng)子低甲基化機(jī)制。