骨形態(tài)發(fā)生蛋白2在小鼠模型中誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化的機制

陳 翔，汪萍萍

脊柱手術(shù)是目前治療脊椎相關(guān)疾病的主要方法之一，在部分病人中，需要進(jìn)行脊柱間融合，脊柱融合的穩(wěn)定性也直接決定了手術(shù)遠(yuǎn)期預(yù)后[1-4]。而脊柱融合過程中需要選擇適合的植骨材料，臨床研究顯示植骨過程中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)能夠加強脊柱融合的效果并降低手術(shù)出血等指標(biāo)，但近年較多研究提示脊柱手術(shù)中加入BMP-2也會增加不良反應(yīng)發(fā)生率，主要包括頸椎前部水腫、移植物發(fā)生沉降、骨質(zhì)溶解以及手術(shù)相關(guān)感染等，骨溶解可引起手術(shù)節(jié)段終板的損壞以及骨量的流失，最終導(dǎo)致手術(shù)效果差[5-9]。骨溶解被認(rèn)為與破骨細(xì)胞異?；罨嘘P(guān)，BMP-2在破骨細(xì)胞異常活化中的作用機制尚無統(tǒng)一意見?；诖?，本研究旨在探討破骨細(xì)胞活化誘導(dǎo)骨溶解的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇3～5周齡雄性的C57小鼠30只(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，動物合格證號為：SCXK(京)，20180019，飼養(yǎng)于我院動物實驗中心，自主進(jìn)食和水。其中20只小鼠按照隨機數(shù)字法分組，對照組和實驗組各10只，剩余10只用于提取巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMMs)。實驗涉及的動物倫理問題已經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 脫鈣骨基質(zhì)及小鼠BMP-2蛋白購自武漢艾美捷科技有限公司，RANKL試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，M-CSF試劑盒購自長沙達(dá)爾鋒生物科技有限公司，PCR試劑盒購自上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Smad1蛋白一抗、p65蛋白一抗及二抗、Western blotting檢測試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司，TRAP試劑盒、BCA蛋白試劑盒購自美國Sigma公司，酶標(biāo)儀購自北京普天新橋技術(shù)有限公司，PCR儀購自深圳市瑞安康醫(yī)療器械有限公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購自英國CLEAVER公司，光學(xué)顯微鏡購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，微型CT儀購自江蘇平生醫(yī)療科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠手術(shù)模型構(gòu)建 所有小鼠均接受脊柱后外側(cè)入路的橫突間融合手術(shù)，實驗組植入脫鈣骨基質(zhì)和BMP-2，對照組植入骨松質(zhì)。方法參照韓興龍[10]的方案，具體方法為：3%濃度的戊巴比妥以50 mg/kg體質(zhì)量計算用量，采用腹腔注射麻醉，麻醉后小鼠俯臥位放置于操作手術(shù)臺上，去L4、L5棘突部位行長約15 mm的正中切口，再沿棘突側(cè)面行一個左側(cè)旁正中切口，鈍性分離L4～L5椎旁肌，清除附著軟組織充分顯露L4及L5的橫突并去除骨皮質(zhì)，直至橫突滲血，將脫鈣骨基質(zhì)修型，使其能夠順利固定在L4與L5的橫突間，實驗組加入BMP-2，對照組無處置，覆蓋軟組織并進(jìn)行縫合，閉合切口，手術(shù)由一位操作能力強的醫(yī)生完成，術(shù)后給予抗生素預(yù)防感染。

1.3.2 小鼠脊柱手術(shù)后影像學(xué)檢查 分別在手術(shù)后1周、2周、4周進(jìn)行微型CT復(fù)查，觀察椎間融合情況，留取圖像資料，在CTAn軟件中評估涉及的骨量、骨小梁厚度以及骨小梁間隙。

1.3.3 BMMs的提取及破骨細(xì)胞誘導(dǎo) 取10只C57小鼠采取頸椎脫臼法處死，剪開皮膚顯露雙下肢，剝離股骨及脛骨處上的其他組織，先從髖關(guān)節(jié)處分離下肢骨骼，注意保護(hù)好股骨頭，并在膝關(guān)節(jié)處離斷股骨和脛骨，清理干凈，置于75%乙醇進(jìn)行浸泡5 min，再置入含有雙抗的PBS液中。用新剪刀剪開股骨及脛骨的一側(cè)，用1 mL注射器吸取α-MEM培養(yǎng)基(含有雙抗及10%PBS液)放置在另一側(cè)，剪開另一側(cè)股骨及脛骨的另一側(cè)，推注混合液使其骨髓進(jìn)入10 mL的培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中加入RANKL(50 ng/μL)及M-CSF(30 ng/mL)，并在各個培養(yǎng)皿中加入不同濃度的BMP-2稀釋液(0、30、60、90、120 ng/mL)，用吸管吹打至均勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%的CO2。培養(yǎng)5 d后全部換液繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)BMMs的細(xì)胞密度達(dá)到90%時接種至96孔板內(nèi)，觀察其破骨細(xì)胞情況待用。

1.3.4 TRAP染色檢測破骨細(xì)胞 在冰箱中取出TRAP試劑盒恢復(fù)至室溫，配置固定液，固定液成分為枸櫞酸鹽25 mL、丙酮65 mL及 37%甲醛8 mL，按照操作說明配置TRAP顯色液。取出BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞孔板，用PBS漂洗2次，孔內(nèi)加入100 μL的細(xì)胞固定液，固定30 s后棄除，PBS漂洗2次。每孔內(nèi)加入100 μL的TRAP染色液，37 ℃孵育1 h，棄除染色液，PBS漂洗2次。光鏡下觀察5個視野內(nèi)的TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)及總面積。

1.3.5 PCR檢測破骨細(xì)胞mRNA 待BMMs細(xì)胞誘導(dǎo)為破骨細(xì)胞后，應(yīng)用RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，采用Trizol法進(jìn)行細(xì)胞中總RNA的提取，并對RNA的純度進(jìn)行檢測，提取20 μg的總RNA，對提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄操作參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書要求。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s， 共40個循環(huán)，循環(huán)完成后在72 ℃條件下繼續(xù)延伸10 min。采用FS2000系統(tǒng)進(jìn)行分析，并采用2-△△CT的方法計算BMP-2、Smad1及p65相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.6 Western blotting法測定相關(guān)通路蛋白 取出BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞孔板，加入細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行裂解30 min，收集1.5 mL裂解后細(xì)胞溶液于離心管中，在預(yù)冷4 ℃的離心機中5 000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)95 ℃煮沸后，應(yīng)用二喹啉甲酸法檢測總蛋白濃度。提取40 μg的總蛋白，將其在120 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，采用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，在室溫條件下用50 g/L的脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h。加入稀釋的Smad1蛋白一抗、p65蛋白一抗(1∶1 000)，在4 ℃條件下進(jìn)行孵育備用。第2天用PBS液稀釋洗滌孵育后的溶液，重復(fù)3次，然后加入稀釋二抗(1∶1 000稀釋)孵育2 h，用PBS稀釋液重復(fù)洗滌3次，然后用二氨基聯(lián)苯胺顯影液處理樣本。采用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗及相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠脊柱融合結(jié)果評價 2組小鼠接受脊柱后外側(cè)入路的橫突間融合手術(shù)后，實驗組小鼠術(shù)后的脊柱融合情況強于對照組(見圖1)。2組小鼠術(shù)后1、2、4周骨小梁體積和骨小梁厚度均呈增高趨勢，骨小梁間隙呈降低趨勢(P<0.01)。實驗組術(shù)后1、2、4周骨小梁體積高于對照組，實驗組術(shù)后2、4周骨小梁間隙低于對照組(P<0.01)，其余差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.2 RANKL聯(lián)合BMP2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞結(jié)果 BMMs在不同濃度BMP-2、RANKL及M-CSF誘導(dǎo)5 d后破骨細(xì)胞結(jié)果見圖2。在BMP-2濃度為60、90及120 ng/mL時破骨細(xì)胞總數(shù)和總面積均高于BMP-2濃度為0、30 ng/mL時(P<0.01)，而在BMP-2濃度為0與30 ng/mL時比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在BMP-2濃度為60、90及120 ng/mL時比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表2 脊柱融合術(shù)后骨小梁相關(guān)指標(biāo)對比

q檢驗：與1周組比較**P<0.01；與2周組比較##P<0.01

2.3 PCR測定BMP-2、Smad1及p65 mRNA表達(dá) BMP-2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)的在0 ng/mL與30 ng/mL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在其余濃度間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Smad1 mRNA表達(dá)在不同濃度BMP-2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)；p65 mRNA表達(dá)在不同BMP-2濃度誘導(dǎo)破骨細(xì)胞對比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)。兩種mRNA進(jìn)行線性分析，結(jié)果顯示Smad1和p65呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.215，P<0.05)(見表4)。

BMP-2濃度/ng/mLn破骨細(xì)胞總數(shù)/個破骨細(xì)胞總面積/(×103μm2)0 1076.65±6.392.67±0.65301079.18±7.392.89±0.7760 10113.43±9.10??##6.15±0.89??##90 10105.92±8.85??##5.72±0.78??##120 10110.27±8.77??##5.52±0.68??##F—47.1248.43P—<0.01<0.01MS組內(nèi)—66.6980.576

q檢驗：與0 ng/mL比較**P<0.01；與30 ng/mL比較##P<0.01

2.4 BMP-2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞后Smad1及p65蛋白表達(dá) 在不同濃度BMP-2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞后檢測Smad1及p65蛋白的表達(dá)對比，結(jié)果顯示在不同濃度BMP-2下Smad1、p65蛋白差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表4)。對Smad1及p65 蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行線性分析，結(jié)果顯示Smad1及p65 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.249，P<0.05)。

3 討論

本研究對小鼠實施脊柱后外側(cè)入路的橫突間融合手術(shù)，結(jié)果顯示兩種方式均能獲得良好的效果，而加用BMP-2融合效果更明顯。應(yīng)用CTAn軟件評價融合術(shù)后骨小梁情況，結(jié)果顯示，加用BMP-2小鼠在骨小梁體積及骨小梁間隙方面高于未添加小鼠，而在骨小梁厚度方面則無差異。綜合分析其原因可能為：未添加BMP-2小鼠脊柱術(shù)后融合效果良好，排除了手術(shù)、脫鈣骨基質(zhì)帶來的干擾，加用BMP-2后，可以有效增加誘導(dǎo)脊柱骨性融合，明顯提高骨生長相關(guān)指標(biāo)，BMP-2可能通過介導(dǎo)骨細(xì)胞生長促進(jìn)脊柱融合。與朱衛(wèi)國等[11-13]研究結(jié)果相近。

在體外實驗中，提取骨髓來源的巨噬細(xì)胞，應(yīng)用RANKL及M-CSF試劑對其進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生破骨細(xì)胞，結(jié)果顯示誘導(dǎo)破骨細(xì)胞總數(shù)為(76.65±6.39)個，面積為(2.67±0.65)×103μm2，表明本次研究構(gòu)建體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞模型成功，與既往研究結(jié)果相似。在加入60、90、120 ng/mL BMP-2培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞總數(shù)及面積明顯高于未添加和30 ng/mL，而BMP-2濃度在60、90、120 ng/mL比較無差異，在未添加和30 ng/mL之間也無差異。結(jié)果顯示BMP-2可能參與了誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化的過程，并且隨著濃度的持續(xù)增加，其破骨細(xì)胞活化未能一直增高，分析原因可能為BMP-2可能參與了破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的過程，其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞表達(dá)水平可能與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的受體數(shù)量有關(guān)，當(dāng)受體配體匹配飽和后，增加BMP-2濃度無法增加誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化能力。高?；吹萚14]研究對仿生殼聚糖載體包裹的BMP-2誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果提示BMP-2能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。PHAM等[15]研究顯示增加BMP-2數(shù)量可以提高TWSG1過表達(dá)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞數(shù)量，本次研究結(jié)果與之一致。我們檢測了體外實驗誘導(dǎo)破骨細(xì)胞BMP-2 mRNA，在不同濃度BMP-2加入時其表達(dá)水平不同，說明外源性加入BMP-2對內(nèi)源性表達(dá)有影響作用，但具體的作用還需進(jìn)行探討。對誘導(dǎo)破骨細(xì)胞后Smad1及p65 mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，隨著BMP-2濃度增加表達(dá)水平均有所提高，并且Smad1及p65 mRNA及蛋白表達(dá)具有相關(guān)性。我們推測在BMP-2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化過程中，Smad1及p65可能參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。而繆雄[16]研究也證實了BMP-2通過激活Smad1及p65信號通路，進(jìn)而促使破骨細(xì)胞活化致使骨溶解，支持本次研究結(jié)果。因此，我們總結(jié)了BMP-2在誘導(dǎo)小鼠破骨細(xì)胞活化的機制，具體為BMP-2激活Smad1，使Smad1磷酸化，進(jìn)而激活p65 磷酸化，促進(jìn)磷酸化的p65 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)破骨細(xì)胞活化。

BMP-2濃度/(ng/mL) nBMP-2Smad1p650 101.265±0.0320.786±0.0220.985±0.045 30 101.672±0.0451.879±0.342?3.768±0.937??60 106.726±1.027??##4.172±0.769??##4.872±1.209??#90 108.241±1.227??##▲▲6.384±1.673??##▲▲6.412±1.238??##▲▲120109.452±1.544??##▲▲△△7.259±1.594??##▲▲8.195±1.463??##▲▲△△F—144.5764.3161.80P—<0.01<0.01<0.01MS組內(nèi)—0.9891.2101.203

q檢驗：與0 ng/mL 比較*P<0.05，**P<0.01；與30 ng/mL比較#P<0.05,##P<0.01；與60 ng/mL組比較▲▲P<0.01；與90 ng/mL比較△△P<0.01

在本次研究中，總結(jié)了小鼠脊柱手術(shù)模型實驗中的注意事項：(1)構(gòu)建動物模型時，將BMP-2注射入小鼠脛骨內(nèi)，因小鼠脛骨較細(xì)，注射時避免針尖未完全注入骨髓腔或刺破骨內(nèi)側(cè)壁，在注射時注意回抽確認(rèn)位置；(2)BMP-2慢病毒載體在注入小鼠脛骨內(nèi)，其表達(dá)程度難以穩(wěn)定，小鼠的免疫系統(tǒng)會消化清除部分BMP-2慢病毒載體，需要進(jìn)行幾次預(yù)實驗對BMP-2表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行評估；(3)在選取動物時，因考慮實驗經(jīng)濟(jì)成本等條件，本次選擇小型動物，具有簡便、可行性高等特點，未建立大型動物模型。

綜上所述，BMP-2應(yīng)用在小鼠脊柱手術(shù)模型中能夠促進(jìn)骨融合，BMP-2參與誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化的過程，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化可能通過Smad1/p65信號通路。