定量檢測WT-1基因在急性白血病病人中的表達(dá)及臨床意義

施青青，吳 蔚，孫 幸，方悅之，朱 淼，顧 健，倪 軍

Wilms 基因(WT-1)最早于1990年由CALL等在Wilms瘤中發(fā)現(xiàn)，定位于人類染色體11p13[1]，最早發(fā)現(xiàn)與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，命名為Wilms瘤Ⅰ型基因[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，WT-1可調(diào)控造血細(xì)胞增生和分化基因的轉(zhuǎn)錄或激活，與急性髓系白血病(AML)等多種腫瘤性疾病密切相關(guān)。因此，可作為白血病的特異性分子標(biāo)志。本研究通過測定WT-1基因在非腫瘤病人和AML病人骨髓細(xì)胞的表達(dá)水平，比較AML病人和對照組以及AML各亞型WT-1基因水平的差異，并分析其與病人臨床特征、療效及預(yù)后的關(guān)系，為應(yīng)用WT-1監(jiān)測AML病人微小殘留病和對AML病人進(jìn)行預(yù)后分層提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2017年4月在我院血液科住院經(jīng)收治的初診AML病人66例，其中男33例，女33例；年齡15～81歲。所有病人根據(jù)WHO白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行骨髓形態(tài)分析、免疫分型、染色體檢查、基因診斷(MICM)分析確診，其中急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)病人8例，急性非淋巴細(xì)胞白血病ANLL病人58例(M1型9例，M2型39例，M4型7例，M5型2例，M7型1例)；并選同期健康體檢的非腫瘤病人20例為對照組，均排除其他惡性腫瘤、感染疾病。

治療標(biāo)準(zhǔn)參照2011年版《中國成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病診療指南》、2014年版《中國急性早幼粒細(xì)胞白血病診療指南》進(jìn)行化療，所有入組病例均為首次接受規(guī)范一個療程化療。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 收集所有研究對象的骨髓4 mL，2%EDTA 抗凝，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后加入1 mL Trizol(Invitrogen)，吹打均勻，置于-80 ℃保存，直至RNA提取?？俁NA的提取按照Trizol試劑說明進(jìn)行，經(jīng)紫外分光光度計測定A 260 nm/A 280 nm比值，鑒定RNA純度及定量后，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 qRT-PCR檢測 采用一步法實時熒光定量PCR檢測WT-1基因mRNA。儀器為ABI7500熒光檢測儀，試劑來源于上海源奇生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的腫瘤相關(guān)基因WT-1檢測試劑盒，步驟按照試劑盒操作說明書操作。反應(yīng)條件為42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，PCR循環(huán)第二步60 ℃收集熒光信號。反應(yīng)體系為25 μL。

1.2.3 WT-1基因表達(dá)水平的計算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算出各份標(biāo)本的Abelson原癌基因(ABL)和WT-1的拷貝數(shù)。以ABL的表達(dá)作為內(nèi)參照。如果ABL基因的表達(dá)水平低于103，則本份標(biāo)本視為RNA質(zhì)量不合格，予以剔除。WT-1表達(dá)水平=(WT-1拷貝數(shù)/ABL拷貝數(shù))×100%。以58例ANLL病人WT-1的中位表達(dá)水平作為界值(cut-off point)，分為WT-1基因高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析、q檢驗、χ2檢驗和秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 WT-1 基因在AML與對照組中的表達(dá)差異 66例AML病人，59例檢測到WT-1的表達(dá)，陽性率為89.4%；20例非腫瘤病人，6例檢測WT-1的表達(dá)，陽性率為30%，2組WT-1表達(dá)率相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.34，P<0.01)。 各組WT-1表達(dá)水平相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.206，P<0.05)，與對照組相比，APL病人和ANLL中分組為M1的病人的WT-1表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ANLL病人各亞型間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.981，P<0.05)，與M1組病人相比，M2組和M3組病人的WT-1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 不同組間WT-1轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平比較

與對照組比較*P<0.05;與M1組比較△P<0.05

2.2 不同WT-1表達(dá)組AML病人的臨床指標(biāo) 以58例ANLL病人WT-1的中位表達(dá)水平作為界值，將其分為WT-1高表達(dá)組和低表達(dá)組，不同WT-1表達(dá)組AML病人性別、年齡、骨髓原幼細(xì)胞比例、外周血白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、血小板數(shù)、乳酸脫氫酶(LDH)、 C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)等臨床指標(biāo)統(tǒng)計見表2。結(jié)果顯示：與WT-1低表達(dá)組相比，WT-1高表達(dá)組中骨髓原幼細(xì)胞比例、外周血白細(xì)胞數(shù)、CRP顯著升高(P<0.05)；而性別、年齡、血紅蛋白、血小板數(shù)、LDH、PCT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 WT1的表達(dá)與初診ANLL病人臨床特征比較

*示χ2值

2.3 不同WT-1表達(dá)組AML病人的預(yù)后危險度分級 58例ANLL病人完善染色體核型分析及基因檢查，WT-1高表達(dá)組有10例存在染色體核型異常，其中t(8;21)(q22;q22)/AML1-ETO和11p+各 2例，inv(16)(p13q22)/CBFB-MYH11、-y、8q-、+11、+21、del(20)(q11,2q3.1)各1例，基因突變檢測到NPM1突變2例，C/EBPα突變1例，C-kit 突變1例，F(xiàn)LT3-ITD突變1例，NPM1、FLT3-ITD、DNMT3α突變1例；WT-1低表達(dá)組有6例染色核型異常，其中t (8;21)(q22;q22)、inv(16) (p13q22)、del(12)(q22q35)、del(5)(p11,2p13)、多倍體、復(fù)雜核型各1例，C-kit突變1例，NPM1突變1例，C/EBPα突變2例，F(xiàn)LT3-ITD突變1例，NPM1、FLT3-TKD突變2例，NPM1、DNMT3α突變1例。根據(jù)《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南(2017版)》進(jìn)行預(yù)后危險度分級，WT-1 高表達(dá)組預(yù)后良好4例，預(yù)后中等22例，預(yù)后不良3例，WT-1 低表達(dá)組預(yù)后良好6例，預(yù)后中等20例，預(yù)后不良3例，2組間病人預(yù)后水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(uc=394.50,P>0.05)(見表3)。

2.4 不同WT-1表達(dá)組AML病人初次誘導(dǎo)后療效評估 8例APL病人在觀察期內(nèi)，2例病人發(fā)生顱內(nèi)出血死亡，其余6例均初次誘導(dǎo)達(dá)完全緩解(CR)。58例ANLL病人中，WT-1高表達(dá)組與低表達(dá)組初次誘導(dǎo)CR率分別為53.6 %和82.8 %，高表達(dá)組AML病人CR率顯著低于低表達(dá)組(P<0.05)；WT-1高表達(dá)組與低表達(dá)組獲得CR的病人半年內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為29.2%和14.3%，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

3 討論

WT-1基因的異常表達(dá)與造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。在惡性血液腫瘤的發(fā)病中，WT-1主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，一方面在造血干細(xì)胞早期分化階段，WT-1通過抑制IGF-Ⅱ、PDGF-A、GM-CSF、TGF-β等與調(diào)控細(xì)胞的生長、分化的基因，阻礙造血干細(xì)胞正常分化；另一方面當(dāng)WT-1發(fā)生突變，抑制轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖而發(fā)生異常[5]。作為“泛白血病標(biāo)志”，定量檢測血液腫瘤病人血液及骨髓WT-1 mRNA的表達(dá)水平，對于疾病監(jiān)測、化療效果評估及預(yù)后判斷等方面具有重要的意義[6]。本文利用熒光定量PCR技術(shù)檢測WT-1基因在正常人和AML病人骨髓細(xì)胞的表達(dá)水平，比較AML病人和對照組以及AML各亞型WT-1基因水平的差異。結(jié)果表明，AML病人WT-1表達(dá)水平明顯高于非腫瘤病人，同時發(fā)現(xiàn)WT-1基因在AML的亞型M1中表達(dá)水平顯著高于其他亞型(P<0.05)，與以往報道[7-9]一致。

表3 不同WT-1表達(dá)組AML病人初次誘導(dǎo)后療效評估(ni=29)

分組初次緩解 初次未緩解半年復(fù)發(fā) 半年未復(fù)發(fā)WT-1高表達(dá)組16 138 21WT-1低表達(dá)組24 54 25χ23.950.95P<0.05>0.05

本研究分析WT-1的表達(dá)與病人臨床特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示W(wǎng)T-1表達(dá)水平與病人性別、年齡、血紅蛋白、血小板等臨床特征無顯著相關(guān)性，與以往[10-11]報道一致。而WT-1高表達(dá)組骨髓原幼細(xì)胞比例、外周血白細(xì)胞量顯著高于WT-1低表達(dá)組，這與前人研究存在一定差異。ADEL等[12]已經(jīng)證實WT-1的表達(dá)水平與骨髓中幼稚細(xì)胞的數(shù)量和比例相關(guān)，在骨髓原幼細(xì)胞中高表達(dá)，與白血病病人的腫瘤負(fù)荷相關(guān)，而HAGAG等[13]研究結(jié)果顯示，WT-1的表達(dá)與外周血白細(xì)胞量、骨髓原幼細(xì)胞比例間無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。研究結(jié)果的差異可能與病人的差異、病人數(shù)量、WT-1基因亞型及突變等因素有關(guān)。LDH是一種糖酵解酶，存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，研究[14]表明白血病細(xì)胞惡性增殖和壞死可引起血清LDH增高。CRP作為急性正時相反應(yīng)蛋白，可快速監(jiān)測和診斷機(jī)體感染、炎癥發(fā)生反應(yīng)[15]。PCT是無激素活性的降鈣素前肽糖蛋白，隨感染的加重或好轉(zhuǎn)而持續(xù)升高或降至正常，可以作為感染預(yù)后的判斷指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示與低表達(dá)組相比，WT-1高表達(dá)組LDH、CRP、PCT均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

近年來，細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)不僅為白血病的診斷提供更多的遺傳分子標(biāo)志，而且為白血病危險度分級以及預(yù)后評估提供依據(jù)。58例ANLL病人中，常見的t(8;21)(q22;q22)、inv(16)(p13q22)、NPM1突變但不伴有FLT3-ITD突變、C/EBPα雙突變通常是預(yù)后良好的類型，而復(fù)雜核型(≥3種)、FLT3-ITD突變、DNMT3α突變通常是預(yù)后不良的類型，其他類型均為預(yù)后中等。本文分析了AML病人WT-1基因不同表達(dá)組危險度分級的差異，發(fā)現(xiàn)2組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本文通過比較AML病人WT-1基因高表達(dá)組和低表達(dá)組首次誘導(dǎo)化療CR率和半年內(nèi)復(fù)發(fā)率的差異，探討該基因?qū)ML病人療效和預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，WT-1基因高表達(dá)組CR率明顯低于低表達(dá)組，而2組復(fù)發(fā)率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與前人研究結(jié)果相符[17-19]，表明WT-1基因可作為判斷療效和預(yù)后的一項指標(biāo)。

綜上所述，AML病人WT-1表達(dá)與外周血白細(xì)胞數(shù)量、骨髓原幼細(xì)胞比例、CR率及復(fù)發(fā)率存在一定的相關(guān)性，揭示W(wǎng)T-1在AML病人骨髓細(xì)胞中表達(dá)水平可作為臨床評估疾病的預(yù)后、療效的指標(biāo)，盡管目前WT-1基因在AML病人過表達(dá)具體機(jī)制還不明確，但WT-1基因已作為重要的分子標(biāo)志來判斷AML病人預(yù)后以及監(jiān)測微小殘留病灶，隨著研究的深入，該基因在AML病人預(yù)后分層、微小殘留病灶監(jiān)測及作為靶向基因指導(dǎo)治療將起更加重要的作用。