丹皮酚對食管癌細胞放射增敏作用及其機制

余定玥，郭加友，馮 琛，馬志宇，郭嘉漪，馬建新

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤。全球每年新增食管癌40余萬，包括2種主要組織學(xué)亞型：食管鱗癌和食管腺癌。我國為食管鱗癌的高發(fā)地區(qū)。早期食管鱗癌病人優(yōu)先選擇外科手術(shù)治療，然而，食管癌的早期往往是非特異性的，大多數(shù)病人不重視本病，延誤病情，喪失了手術(shù)切除的機會。因此放射治療被廣泛應(yīng)用于中晚期食管癌病人中，尤其是食管鱗癌[1]。然而食管癌細胞對放射治療為中度敏感，除食管癌的分期分型外，放射抗性也是局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因之一[2]。因此尋找高效安全、優(yōu)質(zhì)價廉的藥物，用來增加腫瘤組織細胞的放射敏感性有著十分重要的臨床意義。丹皮酚是徐長卿粉末和牡丹皮，在中藥提取為一種小分子酚類化合物，白色針狀樣晶體，化學(xué)名稱為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，相對分子質(zhì)量為166，分子式為C9H10O3。丹皮酚味苦、辛，熔點較低(51～52 ℃)，微溶于水，溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚、丙酮、苯和二硫化碳等有機溶劑[3]。近些年大量研究[4-6]均表明，在肝癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌等體內(nèi)外細胞實驗中，丹皮酚可通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，既有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、調(diào)控細胞周期，又有影響腫瘤血管生成、促進機體白細胞介素(IL)-2及腫瘤壞死因子α(TNF-α)生成的作用，以此發(fā)揮明顯抗癌效應(yīng)的作用。因此本研究以食管鱗癌細胞株KYSE450和TE10為研究對象，探討丹皮酚對食管癌放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 丹皮酚(Sigma公司)以二甲基亞砜(DMSO)為原料，4 ℃儲存在冰箱中。用RPMI 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)稀釋成工作液。工作液中DMSO(美國Sigma公司)的最終濃度≤0.1%。胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO公司，細胞增殖毒性試驗(CCK8)試劑盒、蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、GAPDH抗體購自CST公司。流式細胞術(shù)(FCM)是美國BD公司的產(chǎn)品，化學(xué)發(fā)光儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 人類食管癌細胞株KYSE450、TE10購于上海細胞所。在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中每隔2～3 d傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞照射(IR) 采用瑞典Elekta醫(yī)用直線加速器6 MV-X，將細胞培養(yǎng)皿放在1 cm厚有機玻璃板上，源皮距為100 cm，框架角度為180°照射，每分鐘劑量率為450 cGy。

1.4 CCK8實驗 收集對數(shù)生長期細胞，胰酶消化并按4×103個細胞/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的細胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后將丹皮酚按濃度梯度20、40、80、160、320 mg/L加入96孔板中，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置對照組(不含丹皮酚，含等量培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。避光加入CCK8檢測液(由CCK8原液與空白培養(yǎng)基1∶10配置)，每組設(shè)置一個空白組(不含細胞，只含CCK8檢測液)，繼續(xù)在5% CO2孵箱中37 ℃培養(yǎng)2 h，然后用酶標(biāo)儀檢測各組細胞的450 nm吸光度(A)。采用細胞存活率=(加藥組值-空白組)/(對照組值-空白組)×100%方式計算細胞存活率。實驗重復(fù)3次，繪制藥物濃度-效應(yīng)曲線，以平均值、藥物濃度為橫坐標(biāo)、存活分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，并計算半數(shù)最大抑制濃度(IC50)。

1.5 克隆形成實驗 收集對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化并計數(shù)。依照每塊6孔板接受的不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)分別接種相應(yīng)的細胞數(shù)(300、600、1 200、3 000、6 000個/孔)，置入37 ℃、5% CO2的細胞孵箱中過夜培養(yǎng)，然后加入40 mg/L、100 mg/L的丹皮酚工作液，將細胞分組為：對照組、40 mg/L丹皮酚組和100 mg/L丹皮酚組，每組均設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行照射。X射線照射后4 h更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d肉眼可見克隆后收獲細胞。棄去培養(yǎng)基，加入1 mL PBS清洗2次后，加入1 mL多聚甲醛固定15 min，再加入雙蒸水清洗干凈后加入1%結(jié)晶紫染色30 min。再次雙蒸水清洗干凈。在處理過程中動作輕柔，切勿損傷細胞克隆。6孔板室溫下風(fēng)干后在顯微鏡下計數(shù)克隆(≥50細胞)個數(shù)。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細胞術(shù) 取對數(shù)生長期的食管癌細胞株KYSE450和TE10細胞，用胰蛋白酶消化，按1×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中。將種植好的6孔板按照以下分組：對照組、40 mg/L丹皮酚組和100 mg/L丹皮酚組。同時設(shè)立3個復(fù)孔。過夜培養(yǎng)后，吸凈6孔板內(nèi)原有的培養(yǎng)基，按照分組分別加入含有濃度為40 mg/L、100 mg/L的丹皮酚工作液。處理后放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。24 h后，予以8 Gy的X射線照射。照射后，將細胞放入細胞孵箱中，繼續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)。48 h后收集細胞上清及胰酶消化所有細胞放入編號相應(yīng)的離心管內(nèi)。離心，用PBS輕柔吹洗2～3次。將收集到的細胞轉(zhuǎn)入細胞流式管，離心棄上清后每管加入300 μL的結(jié)合緩沖液，再加入FITC標(biāo)記的Annexin-V(20 μg/mL)10 μL，而后加入PI(50 μg/mL)5 μL，輕柔混勻后避光反應(yīng)15 min后上機檢測。1 h內(nèi)結(jié)束所有的細胞標(biāo)本檢測。

1.7 Western blotting實驗 實驗按要求分組，每次處理后根據(jù)蛋白提取試劑盒的指示提取總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度并配平，加入5×上樣緩沖液混勻，煮沸約5 min。每泳道加入20 μL樣品，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用10%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌3次，每次10～15 min，一抗(Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、GAPDH抗體均按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜)，然后TBST洗滌3次，每次10～15 min。用1∶2 000稀釋的抗兔抗體和抗鼠抗體在搖瓶中孵育1 h后，用TBST洗滌3次，每次洗滌10～15 min，而后利用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚抑制食管癌細胞的增殖活性 CCK8實驗表明丹皮酚對于食管鱗癌細胞具有顯著的藥物毒性，它能夠抑制食管鱗癌的增殖活性，其作用是劑量依賴性的(P<0.05～P<0.01)(見表1)。丹皮酚作用細胞24 h后，其在KYSE450和TE10細胞中的IC50分別為104.48 mg/L和207.87 mg/L。因此，選擇40 mg/L和100 mg/L濃度的丹皮酚應(yīng)用于后續(xù)實驗。

表1 CCK8實驗檢測食管癌細胞增殖活力(%；ni=12)

q檢驗：與空白組比較*P<0.05；與丹皮酚20 mg/L組比較#P<0.05；與丹皮酚40 mg/L組比較△P<0.05；與丹皮酚80 mg/L組比較◇P<0.05；與丹皮酚160 mg/L組比較□P<0.05

2.2 丹皮酚對人食管鱗癌細胞KYSE450和TE10克隆形成能力的影響 為了驗證丹皮酚關(guān)于食管鱗癌細胞的放射治療增敏作用，我們用不同濃度的丹皮酚處理食管鱗癌細胞。經(jīng)過單擊多靶模型處理后，丹皮酚抑制KYSE450細胞的克隆形成，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系(見圖1A)。應(yīng)用單擊多靶模型公式[SF=1-(1-e-D/D0)n]計算SF值。丹皮酚在TE10細胞的克隆形成實驗中同樣表現(xiàn)出顯著差異(見圖2B),放射治療劑量在2 Gy時，40 mg/L或100 mg/L濃度的丹皮酚處理后的KYSE450細胞的存活率(SF2)分別為0.48和0.37(見表2)；同樣處理后的TE10細胞的存活率(SF2)分別為0.48和0.35(32)。

表2 丹皮酚對于KYSE450細胞的放射治療增敏作用

表3 丹皮酚對于TE10細胞的放射治療增敏作用

2.3 丹皮酚聯(lián)合X射線照射對于人食管癌細胞KYSE450和TE10細胞凋亡率影響 流式細胞儀檢測丹皮酚或/和放射治療(8 Gy)處理后的細胞凋亡率(見表4)。與丹皮酚、放射治療單獨處理組相比，KYSE450和TE10細胞的聯(lián)合處理組凋亡率顯著增加(見圖2)。隨著丹皮酚的給藥劑量增加，兩者聯(lián)合作用的促凋亡作用更加明顯(P<0.01)。結(jié)果表明，丹皮酚能提高食管鱗癌細胞的凋亡率，提高其放射治療敏感性。

表4 流式細胞儀檢測食管癌細胞凋亡率(%)

2.4 丹皮酚對于食管鱗癌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 為了探究丹皮酚的作用機制，本實驗檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。比較不同處理措施后KYSE450和TE10兩株細胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、PARP蛋白的表達情況。蛋白電泳實驗表明在丹皮酚作用影響下，KYSE450和TE10細胞中促凋亡蛋白PARP、caspase-3、cleaved caspase-3和Bax的表達上調(diào)。相反，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達受到了抑制(見圖3)。

3 討論

食管癌是人類健康的一個重要威脅，尤其在我國食管癌的診治主要受到病人無早期特異性癥狀的影響，導(dǎo)致延誤病情，癌癥發(fā)展，喪失手術(shù)醫(yī)治時機。因此對于局部晚期的食管癌而言，放射治療是無法手術(shù)的食管鱗癌病人的最佳選擇。近年來發(fā)現(xiàn)，放射耐受是癌癥病人預(yù)后不良的重要原因之一，因而尋找高效低毒的藥物以提高腫瘤組織放射敏感性是目前各項研究工作的重點。

近年來各項實驗研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在肺癌、肝癌、食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。丁文秋等[7]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能夠通過影響凋亡相關(guān)蛋白，促進肺癌小凋亡，抑制肺癌細胞增殖，而發(fā)揮抗腫瘤的作用。劉思涵[8]研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚，能夠抑制cox-2、Bcl-2和survivin的表達，從而起到抑制裸鼠體內(nèi)食管癌細胞移植瘤的生長，并誘導(dǎo)凋亡作用的發(fā)生，最終發(fā)揮抗腫瘤作用。楊震等[9]實驗表明，丹皮酚能夠抑制體內(nèi)外食管鱗癌細胞株ECA-109的增長，誘導(dǎo)其凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，丹皮酚對食管癌細胞株KYSE450和TE10具有抑制其增殖的作用。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，丹皮酚提高放療后細胞的凋亡率，從而起到放療增敏的作用。

我們對凋亡相關(guān)蛋白進行了檢測，證明了丹皮酚能夠通過調(diào)控細胞凋亡，從而對食管癌細胞起到抗腫瘤及放療增敏的作用。細胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)控機體發(fā)育及衰老的重要機制[10]。細胞凋亡和細胞增殖通常是動態(tài)平衡的，一旦各項機制導(dǎo)致細胞增殖和細胞凋亡失衡，就會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，這也是各種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[11]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的相互作用，影響著內(nèi)源性線粒體途徑相關(guān)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的調(diào)控[12],從而影響下游分子PARP導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[13]。在Western blotting實驗中，我們檢測到，與兩種不同濃度的丹皮酚單純加藥組和單純放療組相比，Bcl-2在兩種濃度的丹皮酚聯(lián)合放療組中均有不同程度的下調(diào)，同時促凋亡蛋白Bax、caspase-3、cleave caspase-3、PARP均表現(xiàn)為上調(diào)。因此我們可以認(rèn)為，在丹皮酚的作用下，Bax/Bcl-2比率增加，激活caspase蛋白的裂解，從而直接上調(diào)PARP蛋白的表達，啟動凋亡程序的發(fā)生，導(dǎo)致食管癌細胞的凋亡，起到放療增敏，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究表明，丹皮酚體外食管癌細胞放療增敏的機制可能與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、cleave caspase-3和PARP有關(guān)。然而放療增敏機制更為復(fù)雜，可能涉及到多個信號通路。尤其在動物實驗中，丹皮酚的放療增敏機制值得進一步的研究探討。同時丹皮酚對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控是否具有特異性，也值得深入的研究。