白藜蘆醇對(duì)體外胚胎生產(chǎn)的作用機(jī)制

胡慧茹 王健 瞿靜雯 孫曉梅 李擁軍

摘要?白藜蘆醇是存在于70多種植物中的一種多酚物質(zhì)，常見(jiàn)于葡萄、桑椹等植物，具有抗炎、抗老、抗癌的效能。近年來(lái)，白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞、冷凍精液、胚胎質(zhì)量的影響備受關(guān)注。綜述了白藜蘆醇在體外胚胎生產(chǎn)中的應(yīng)用情況，為白藜蘆醇更廣泛地應(yīng)用于胚胎工程試驗(yàn)提供參考。

關(guān)鍵詞?白藜蘆醇，卵母細(xì)胞，冷凍精液，胚胎

中圖分類(lèi)號(hào)?R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0020-03

Abstract?Resveratrol is a polyphenolic substance found in more than 70 kinds of plants.It is commonly found in grapes，mulberry and other plants.Its strong antioxidant activity has antiinflammatory，antiaging and anticancer effects.In recent years，the effects of resveratrol on oocytes，frozen semen，and embryo quality have attracted much attention.This article reviewed the application of resveratrol in vitro embryo production，and provided a reference for the wider application of resveratrol in embryo engineering experiments.

Key words?Resveratrol，Oocyte，F(xiàn)rozen semen，Embryo

我國(guó)輔助生殖技術(shù)經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，已經(jīng)達(dá)到了世界先進(jìn)水平，為成千上萬(wàn)的家庭解決了不孕不育的難題。如超數(shù)排卵、胚胎移植、體外胚胎生產(chǎn)、冷凍保存等，這些輔助生殖技術(shù)不僅在人體方面應(yīng)用廣泛，而且對(duì)提高動(dòng)物繁殖性能和誘導(dǎo)遺傳改良也起到了十分積極的作用。然而，與體內(nèi)環(huán)境條件相比，體外胚胎生產(chǎn)的效率仍相對(duì)較低。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞體外培養(yǎng)條件很難與體內(nèi)生理環(huán)境達(dá)到精準(zhǔn)一致，且細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力不能保護(hù)機(jī)體免于氧化損傷，因此在體外培養(yǎng)過(guò)程中添加抗氧化劑，可以有效保護(hù)卵母細(xì)胞、冷凍精液、胚胎免受氧化應(yīng)激。

白藜蘆醇作為天然多酚，其結(jié)構(gòu)式為3，4′，5-三羥基二苯乙烯，最早是從白藜蘆的根部提取得到的，有順式-（E）和反式-（Z）2種同分異構(gòu)體，通常能夠穩(wěn)定存在并發(fā)揮主要生物活性的是反式結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)這種天然的物質(zhì)廣泛存在于葡萄、桑椹、虎杖等70多種植物中，且它們中大多數(shù)可食用。白藜蘆醇是植物本身為應(yīng)對(duì)外界傷害而合成的一種抗毒素，后來(lái)有科學(xué)家證實(shí)它還有抗氧化、抗癌[1]、抗炎癥[2]和保護(hù)心血管[3]等保健作用。近年來(lái)，將白藜蘆醇作為抗氧化劑用于體外胚胎生產(chǎn)的研究越來(lái)越多，如在卵母細(xì)胞成熟方面，Zabihi等[4]發(fā)現(xiàn)0.25和0.5 μmol/L的白藜蘆醇顯著增加了綿羊卵母細(xì)胞的卵丘擴(kuò)散，添加在牛卵母細(xì)胞成熟液中時(shí)，1.0 μmol/L的白藜蘆醇同樣改善了卵丘擴(kuò)散以及第一極體的排出[5]，在冷凍精液方面，Longobardi等[6]和Gadani等[7]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇雖然對(duì)精子活力無(wú)顯著影響，但50 μmol/L和2 mmol/L可分別提高公牛和公豬冷凍精液的體外受精能力。在胚胎質(zhì)量方面，0.5 μmol/L的白藜蘆醇可顯著提高綿羊胚胎的發(fā)育能力，主要表現(xiàn)在較高的囊胚率和囊胚細(xì)胞總數(shù)[4]，Kwak等[8]在豬的卵母細(xì)胞IVM期間補(bǔ)充2.0 μmol/L白藜蘆醇，發(fā)現(xiàn)它可增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平，降低活性氧（ROS）水平以及調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟期間的基因表達(dá)，從而改善了孤雌激活和體外受精后豬胚胎的發(fā)育潛力。雖然一定濃度的白藜蘆醇對(duì)不同物種的體外胚胎生產(chǎn)具有一定的積極作用，但有研究顯示過(guò)高濃度的白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞的成熟及胚胎具有負(fù)面影響，如Zabihi等[4]研究發(fā)現(xiàn)5.0 μmol/L的白藜蘆醇降低了MII卵母細(xì)胞率、卵裂率、桑椹胚和囊胚率。白藜蘆醇對(duì)卵母細(xì)胞、冷凍精液、以及胚胎發(fā)育等均具有影響作用，筆者探討其在胚胎生產(chǎn)過(guò)程中的作用機(jī)理，為此類(lèi)抗氧化劑更廣泛的應(yīng)用于胚胎工程研究提供參考。

1?白藜蘆醇的抗氧化作用

1.1?白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響

活性氧（ROS）是體內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的一類(lèi)氧單電子還原產(chǎn)物，體外的理化因素（如化學(xué)藥物、輻射、高壓氧等）也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，可以說(shuō)生命活動(dòng)與ROS的產(chǎn)生密切相關(guān)。但對(duì)于化學(xué)性質(zhì)活潑且具有強(qiáng)氧化性的ROS而言，體內(nèi)含量一旦過(guò)高，出現(xiàn)氧化與抗氧化的失衡便會(huì)引起機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，從而引發(fā)疾病或衰老。因此，氧化應(yīng)激亦是胚胎體外產(chǎn)生效率低下的重要原因，而研究顯示白藜蘆醇的抗氧化作用主要是對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。如Mukherjee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在IVM期間，用0.25和0.50 μmol/L的白藜蘆醇處理卵母細(xì)胞，通過(guò)降低ROS水平，為山羊卵母細(xì)胞提供有益的微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和刺激胚胎發(fā)育。Kwak等[8]在豬的卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，即2.0 μmol/L白藜蘆醇通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟期間的基因表達(dá)，并提高豬胚胎的發(fā)育潛力。 不同的是，Santos等[10]研究發(fā)現(xiàn)添加白藜蘆醇并未降低卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平，這可能與不同物種的培養(yǎng)基成分差異有關(guān)。同時(shí)，這也印證了細(xì)胞內(nèi)ROS水平不是受單一因素控制的，氧濃度、光、卵母細(xì)胞處理方式、細(xì)胞代謝反應(yīng)和物理化學(xué)參數(shù)等均可以影響ROS水平[11]。冷凍可以使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，造成細(xì)胞的氧化損傷。戴建軍等[12]發(fā)現(xiàn)在豬卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)基中添加2 μmol/L的白藜蘆醇，可以提高卵母細(xì)胞的線粒體功能，降低氧化損傷，提高卵母細(xì)胞的抗凍能力。李世佳等[13]發(fā)現(xiàn)向人精液冷凍保護(hù)液中添加30 μmol/L的白藜蘆醇，可以降低精子內(nèi)ROS水平，減少精子冷凍損傷，從而改善解凍后精子質(zhì)量和功能。研究表明，玻璃化冷凍前用2 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理未成熟的卵母細(xì)胞，對(duì)隨后胚胎的發(fā)育無(wú)影響，但將該試劑添加在玻璃化冷凍、升溫后的IVM培養(yǎng)基中，改善了囊胚期的胚胎發(fā)育，這說(shuō)明白藜蘆醇雖不能阻止玻璃化造成的細(xì)胞損傷，但可以增強(qiáng)細(xì)胞亞致死的損傷恢復(fù)[10]。

1.2?白藜蘆醇對(duì)機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平的影響

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，含有巰基。它幾乎存在于身體的每一個(gè)細(xì)胞，具有清除自由基和抗氧化的作用。研究表明，在細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中添加白藜蘆醇，可以促進(jìn)GSH的合成。如Mukherjee等[9]發(fā)現(xiàn)在IVM培養(yǎng)基中添加白藜蘆醇，能夠促進(jìn)山羊卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成熟，且通過(guò)增加的細(xì)胞內(nèi)GSH水平促進(jìn)孤雌激活和手工克隆之后胚胎發(fā)育能力。同樣的，在豬卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)基中添加2.0 μmol/ L的白藜蘆醇，能夠增加細(xì)胞內(nèi)GSH水平，降低ROS水平以及調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟期間的基因表達(dá)，改善孤雌激活和體外受精后胚胎的發(fā)育潛力[8]。Li等[14]在研究熱應(yīng)激下豬卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，2.0 μmol/ L白藜蘆醇不僅可以改善核成熟，還可以通過(guò)增加谷胱甘肽（GSH）水平，提高熱應(yīng)激下胚胎孤雌激后的囊胚率。

2?白藜蘆醇對(duì)機(jī)體內(nèi)固醇類(lèi)激素分泌的影響

除抗氧化作用，白藜蘆醇還能影響各類(lèi)固醇類(lèi)激素的分泌。早在2008年，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠顯著增加雄性小鼠睪丸激素的分泌[15]。還有研究指出，白藜蘆醇增加了雌性大鼠顆粒細(xì)胞中P450arom和黃體化相關(guān)基因（如LH-R和StAR）的表達(dá)，這可能促進(jìn)卵巢中的類(lèi)固醇激素的生成和黃體化[16]。孕酮與Mos/MEK1/p42MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路密切相關(guān)，近年來(lái)，Wang等[5]研究顯示，白藜蘆醇顯著上調(diào)C-mos/ERK2/MAPK2基因的表達(dá)，下調(diào)CDC2/CyCB2基因的表達(dá)，證實(shí)了白藜蘆醇可以通過(guò)卵丘細(xì)胞誘導(dǎo)孕酮分泌、降低雌二醇分泌以及自身的抗氧化作用促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟和隨后體外受精的胚胎發(fā)育。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇還是一種植物雌激素，在不同的試驗(yàn)中發(fā)揮不同程度的雌激素受體激動(dòng)劑活性[17]。因此推測(cè)白藜蘆醇在卵母細(xì)胞成熟液中發(fā)揮雌激素樣活性，可以競(jìng)爭(zhēng)性地與卵丘細(xì)胞上的雌激素受體相結(jié)合，達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，便會(huì)通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用降低卵丘細(xì)胞中雌激素分泌[5]。

3?白藜蘆醇對(duì)線粒體功能和能量穩(wěn)態(tài)的影響

線粒體是細(xì)胞能量代謝的重要場(chǎng)所。它可以直接利用氧，但也不斷受到氧毒性的傷害，一旦損傷過(guò)度，細(xì)胞就會(huì)衰老死亡。而沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin1，SIRT1）是NAD+依賴的組蛋白去乙?；竤irtuin家族的成員[18]，對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有抗衰老作用，它的一個(gè)重要作用是上調(diào)線粒體的生物合成[19]。白藜蘆醇是Sirtuin1（SIRT1）的激活劑，它可以通過(guò)抑制磷酸二酯酶來(lái)增強(qiáng)SIRT1的活性[20]。研究表明，白藜蘆醇補(bǔ)充在體外成熟（IVM）培養(yǎng)基中改善了牛和豬卵母細(xì)胞的受精效果和發(fā)育能力，最有可能通過(guò)上調(diào)線粒體生物合成和降解，使卵母細(xì)胞中ATP含量增加[21-22]。而Itami等[23]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇上調(diào)SIRT1的表達(dá)僅增強(qiáng)線粒體功能而對(duì)線粒體數(shù)量沒(méi)有任何影響。SIRT1的另一個(gè)重要作用是與控制細(xì)胞代謝的能量傳感器（腺苷一磷酸激活蛋白酶AMPK）相互作用，影響卵母細(xì)胞的能量穩(wěn)態(tài)，包括上調(diào)氧化磷酸化和脂肪磷酸化[24]。研究表明，AMPK的激活能夠促進(jìn)脂肪酸β-氧化[23]，而且減數(shù)分裂過(guò)程中脂肪酸的消耗與卵母細(xì)胞的發(fā)育能力密切相關(guān)[25]。因此，有學(xué)者認(rèn)為，白藜蘆醇顯著增加卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量是由于SIRT1因子激活P-AMPK（磷酸化）表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸β-氧化，增強(qiáng)線粒體產(chǎn)生ATP的能力，從而大大提高了卵母細(xì)胞向囊胚階段的發(fā)育能力[26]。據(jù)報(bào)道，冷凍保存會(huì)降低胚胎內(nèi)ATP含量和線粒體拷貝數(shù)，這表明冷凍保存可能會(huì)使胚胎中的線粒體受損，而受損線粒體的分解是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的。因此，有學(xué)者將0.5 μmol/L的白藜蘆醇添加在慢速冷凍升溫后的胚胎培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)它可以降低胚胎中mt-cfDNA（游離線粒體之外的DNA，即線粒體受損后裂解，mt-DNA（線粒體DNA）游離于線粒體之外）的含量，增加培養(yǎng)基中mt-cfDNA的含量，說(shuō)明白藜蘆醇增強(qiáng)了受損線粒體的降解，并將mt-DNA分泌到培養(yǎng)基中，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[27]。

4?白藜蘆醇對(duì)體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡在發(fā)育和分化中起關(guān)鍵作用，它是一種正常的細(xì)胞代謝程序，可以有效清除受損的細(xì)胞。然而對(duì)于體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞或胚胎時(shí)由于環(huán)境應(yīng)激等因素所產(chǎn)生的ROS，亦可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。大量研究表明，適當(dāng)濃度的白藜蘆醇通過(guò)調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡有關(guān)基因的表達(dá)，可減少細(xì)胞凋亡。目前，最受關(guān)注的是bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶（caspase） 家族，它包括功能相互對(duì)立的促凋亡（Bax）和抗凋亡（Bcl-2）基因，以及在凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用的凋亡執(zhí)行蛋白酶caspase3。如Kwak等[8]在研究豬卵母細(xì)胞成熟時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加白藜蘆醇對(duì)于Bcl-2的表達(dá)無(wú)顯著影響，但明顯降低了Bax和Caspase-3基因的表達(dá)，抑制了卵母細(xì)胞的凋亡。該結(jié)果在山羊[9]和牛[28]卵母細(xì)胞研究中分別得到了證實(shí)。然而，在人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇還有劑量依賴效應(yīng)，低濃度促進(jìn)細(xì)胞分裂，抑制細(xì)胞凋亡，高濃度則發(fā)揮抗增殖促凋亡作用[29]。如當(dāng)白藜蘆醇的添加量高至10 μmol/L時(shí)，Bax表達(dá)量升高，Bcl-2表達(dá)量下降，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，其中Bcl-2表達(dá)量甚至是低于未添加白藜蘆醇的空白組[12]。這與Torres等[28]和Lee等[30]的研究結(jié)果類(lèi)似。此外，還有一些其他的基因在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，如Kong等[31]對(duì)大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過(guò)減少凋亡蛋白FOXO3a、Bim和P27KIP1的激活，抑制卵母細(xì)胞凋亡，增加卵母細(xì)胞數(shù)量，維持正常的發(fā)情周期，延緩大鼠衰老。

5?小結(jié)

白藜蘆醇作為天然的抗氧化劑，在體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中的作用重大。添加適宜濃度的白藜蘆醇可清除細(xì)胞內(nèi)多余ROS，提高GSH水平，降低氧化應(yīng)激，維持機(jī)體氧化還原平衡，同時(shí)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)類(lèi)固醇激素分泌，改善線粒體功能，維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞體外成熟效果、胚胎的體外發(fā)育潛力以及冷凍精液的受精能力。然而白藜蘆醇在體外胚胎生產(chǎn)中的作用機(jī)制較為復(fù)雜，以及各物種間生理差異，添加濃度相差較大，因此要想明確白藜蘆醇提高體外胚胎生產(chǎn)效率的潛在機(jī)理，還需深入研究。

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