神木天坑兩種藥茶同源植物葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究*

唐健民，朱成豪，秦惠珍，唐啟明，高麗梅，熊雅蘭，蔣昊龍，韋記青

(廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006)

0 引言

苦丁茶(Ilexlatifolia)屬冬青科冬青屬苦丁茶冬青種[1]，常生長(zhǎng)于海拔400-800 m的山谷、溪邊雜木林或灌叢中，主要分布在西南和華南等地區(qū)?？喽〔柚兄饕卸喾?、多糖、生物堿、甾體、三萜、皂苷、黃酮、氨基酸、維生素及對(duì)人體有益的多種微量元素等[2]，是民間一種傳統(tǒng)涼茶飲料，具有清熱鎮(zhèn)痛、清涼解毒、降脂降壓、抑菌減肥之功效[3]。五棱苦丁茶(Ilexpentagona)是冬青科冬青屬植物，多生長(zhǎng)于石灰山林中，其味甘苦，性涼微寒，具有清熱解毒、降壓減肥、抑癌防癌等藥理療效，可作苦丁茶的代用品[4]。異葉梁王茶(Nothopanaxdavidii)系五加科梁王茶屬植物，主要分布于疏林或陽(yáng)性灌叢中、林緣、巖石隙。藥用部位為樹皮，民間草藥，具有抗風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨等功效[5]，彝藥用其根皮、莖皮治療胃病、咽喉熱痛。梁王茶還可以泡開水作茶飲。苦丁茶、五棱苦丁茶、異葉梁王茶是喀斯特地區(qū)的特色藥材及涼茶飲品，廣西桂西北、桂東北及貴州、云南等山區(qū)少數(shù)民族廣泛飲用的保健養(yǎng)身茶，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究采用單因素和響應(yīng)面方法優(yōu)化五棱苦丁茶的總黃酮提取工藝，并采用此工藝提取苦丁茶、五棱苦丁茶和異葉梁王茶的總黃酮，進(jìn)一步對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行體外羥基自由基、超氧陰離子和二苯基苦基苯肼自由基的清除試驗(yàn)[6]，為苦丁茶、五棱苦丁茶、異葉梁王茶的提取工藝研究、開發(fā)利用提供一些科學(xué)理論知識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

五棱苦丁茶、異葉梁王茶采自廣西樂(lè)業(yè)神木天坑(24°48′41″ N,106°28′05″ E)，苦丁茶采自廣西植物研究所(桂林雁山區(qū))。實(shí)驗(yàn)使用3種茶的葉片，烘干粉碎，過(guò)60目篩。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品20 mg，溶于60%乙醇中并定溶于50 mL容量瓶，得到0.4 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液1，2，4，6，8，10 mL置于25 mL容量瓶中，加入10 mL 50%乙醇、1 mL 5%亞硝酸混勻，靜置6 min；然后加入1 mL 10%硝酸鋁混勻并靜置6 min，最后加入10 mL 4%氫氧化鈉并使用50%乙醇定容，靜置15 min后在510 mm處測(cè)定吸光值。獲得總黃酮回歸方程：y=0.1852x+0.031，R2=0.999 5，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 提取工藝

分別稱取樣品粉末0.5 g，按照一定料液比加入40 %乙醇，在適宜溫度下超聲提取一定時(shí)間，提取結(jié)束后，過(guò)濾，定容至50 mL，即得供試品溶液。

精取3 mL試品溶液，加50%乙醇至10 mL，再加入5%亞硝酸鈉1 mL，混勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL，50%乙醇調(diào)至刻度，混勻，靜置15 min后在510 nm處測(cè)定吸光度，按照總黃酮回歸方程計(jì)算總黃酮含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

參考唐健民等[7]，趙娟娟[8]的試驗(yàn)方法，采用乙醇濃度、料液比、溫度、時(shí)間、超聲波功率、超聲波頻率等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析

分析對(duì)比各單因素試驗(yàn)對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響，選取影響總黃酮得率比較大的4個(gè)因素：料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間(表1)，通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行組合試驗(yàn)[9-12]。

1.2.5 體外抗氧化活性試驗(yàn)

·OH清除率(%)=(As—Ap)/(Ab—Ap)×100%，

DPPH·清除率(%)=[A0—(A1—A2)]/A0×100%，

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)水平和因素情況表

Table 1 The table of response surface design levels and factors

水平Level因素FactorA料液比Solid liquid ratio(g/mL)B超聲功率Ultrasonic power (W)C提取溫度Extraction temperature (℃)D提取時(shí)間Extraction time(min)-11∶30180501001∶40300603011∶504207050

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響

如圖1所示，乙醇濃度對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率有較明顯的影響。隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在乙醇濃度為20%時(shí)，總黃酮的得率最低，為2.79%；隨著乙醇濃度增加至40%時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高值4.31%；后期乙醇濃度雖然不斷增加，但總黃酮得率都未能超過(guò)4.31%，因此確定提取總黃酮的最佳乙醇濃度為40%。

2.1.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響

物料的精準(zhǔn)對(duì)于試驗(yàn)成本的節(jié)約非常重要。由圖2可知，料液比從1∶20 (g/mL)增加至1∶30 (g/mL)，總黃酮得率顯著提高；料液比由1∶30 (g/mL)至1∶40 (g/mL)，總黃酮得率增幅平緩；當(dāng)料液比為1∶50 (g/mL)時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最高值5.01%。隨后隨著料液比的增加得率急速下降。因此，結(jié)果表明料液比1∶50 (g/mL)為宜，繼續(xù)增大溶劑量不僅浪費(fèi)溶劑而且還會(huì)降低總黃酮的產(chǎn)出。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響

Fig.1 Effect of different ethanol concentration on flavonoid yield ofIlexpentagona

圖2 不同料液比對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響

Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of total flavonoids ofIlexpentagona

2.1.3 溫度對(duì)總黃酮得率的影響

溫度對(duì)總黃酮的提取影響較大，溫度較低無(wú)法充分浸提;溫度較高則會(huì)破壞化合物的結(jié)構(gòu)，影響總黃酮的產(chǎn)出。從圖3可看出，提取溫度為30℃時(shí)，五棱苦丁茶總黃酮得率只有3.10%；隨著溫度上升，總黃酮的得率也不斷提高，在60℃時(shí)達(dá)到峰值，為4.27%。后期溫度雖然不斷升高，但是總黃酮得率反而逐漸降低，說(shuō)明五棱苦丁茶總黃酮提取的最佳溫度為60℃。

圖3 不同溫度對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響

Fig.3 Effect of different temperature on flavonoid yield ofIlexpentagona

2.1.4 時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

由圖4看出，超聲提取時(shí)間在30 min時(shí)，五棱苦丁茶的總黃酮提取效率最高，達(dá)到4.38%。當(dāng)提取時(shí)間不足30 min時(shí)，提取不完全，得率低；超過(guò)30 min,則隨著時(shí)間的增加，總黃酮得率逐漸下降，說(shuō)明超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空化作用使得總黃酮得率下降。因此，最佳的提取時(shí)間定為30 min。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響

Fig.4 Effect of different extraction time on extraction yield of total flavonoid ofIlexpentagona

2.1.5 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

超聲功率過(guò)小，提取不完全；超聲功率過(guò)高，空化作用會(huì)破壞總黃酮的結(jié)構(gòu)，影響提取率。由圖5可知，五棱苦丁茶總黃酮得率在420 W時(shí)達(dá)到最大值，為4.03%。因此，最佳的超聲功率定420 W。

圖5 不同超聲功率對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響

Fig.5 Effect of different ultrasonic power on yield of flavonoid ofIlexpentagona

2.1.6 超聲頻率對(duì)總黃酮得率的影響

根據(jù)圖6可得，超聲頻率為低頻(35 kHz)時(shí)的提取率優(yōu)于超聲高頻(61 kHz)。超聲低頻時(shí)，五棱苦丁茶總黃酮得率為3.53%；超聲高頻時(shí)，總黃酮得率為3.09%。因此，超聲輔助提取總黃酮時(shí)選擇低頻(35 kHz)。

圖6 不同超聲頻率對(duì)五棱苦丁茶總黃酮得率的影響

Fig.6 Effect of different ultrasonic frequency on yield of total flavonoid ofIlexpentagona

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以料液比、超聲功率、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)(表2)。模型回歸方程為Y=4.52+0.057A+0.11B+0.40C+0.20D-0.035AB+0.11AC-0.054AD-0.073BC+0.002BD-0.046CD-0.23A2-0.15B2-0.39C2-0.25D2，其中Y為總黃酮得率的預(yù)測(cè)值。該模型回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.984 0，矯正系數(shù)AdjR2=0.986 0。由表3可以看出，P<0.000 1，表明此模型在顯著性上極其顯著，試驗(yàn)的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值擬合度比較好，具有較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2 Response surface experimental design and result

序號(hào)No.料液比Solid liquid ratio(g/mL)功率Ultrasonic power(W)提取溫度Exraction tempera ture (℃)提取時(shí)間Exraction time(min)總黃酮得率Total flavonoid yield (%)11∶5042060304.54 21∶5030060603.85 31∶5018060304.47 41∶4030050104.92 51∶4018060604.40 61∶4030060304.56 71∶4018050304.25 81∶4042060103.7191∶3030050304.44101∶4042060603.87 111∶4030060304.34 121∶4030070604.23131∶3030060104.34 141∶4018060103.78 151∶4030050603.75 161∶5030070303.85 171∶3018060303.91 181∶4042050303.90 191∶3030070304.22 201∶4030060303.59 211∶4030060303.72 221∶3030060604.18 231∶3042060304.13 241∶5030050304.06 251∶4030070104.00 261∶5030060103.97 271∶4018070303.96 281∶4042070304.31 291∶4030060304.28

表3 回歸模型的方法分析

Table 3 The method analysis of regression model

方差來(lái)源Sources of variation自由度Degree of freedom平方和Sum of squares均方 Mean squareF值F valueP值P value顯著性Significant模型 Modle143.130.2261.59< 0.000 1??A10.0390.03910.830.005 4B10.160.1642.88< 0.000 1??C11.051.05288.18< 0.000 1??D10.50.5137.46< 0.000 1??AB10.0050.0051.340.266 4AC10.0480.04813.180.002 7??AD10.0120.0123.210.095 0BC10.0210.0215.870.029 5?BD10.000 020.000 020.0060.940 9CD10.0080.0082.330.149 2A210.330.3391.93< 0.000 1??B210.160.1642.84< 0.000 1??C210.970.97268.21< 0.000 1??D210.40.4109.1< 0.000 1??殘差Residue140.0510.003 6失擬誤差Lack of fit100.0450.004 53.360.126 9純誤差Pure error40.0050.001 4總差Gross difference283.18

注：**表示P<0.01，差異極其顯著；*表示P<0.05，差異顯著

Note:** meansP<0.01,the difference is extremely significant;* meansP<0.05,and the difference is significant

2.2.2 模型交互作用分析

通過(guò)Design-Expert 軟件將AC、BC、AD 交互進(jìn)行比較分析，獲得響應(yīng)面曲線圖(圖7)：每個(gè)響應(yīng)曲面都開口向下，呈現(xiàn)凸面形狀，等高線圖3D圖上的投影為最高值，交互作用點(diǎn)突出表示各因素對(duì)總黃酮提取的影響也顯著突出。

2.2.3 條件優(yōu)化與結(jié)果驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面模型優(yōu)化，獲得五棱苦丁茶總黃酮的最佳提取條件：料液比1∶50(g/mL)，超聲功率316.8 W，提取溫度64.9℃，提取時(shí)間35.2 min，提取率為4.47%。用最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)(重復(fù)5次)，得到五棱苦丁茶總黃酮得率的平均值為4.98%。實(shí)際值和預(yù)測(cè)值相差0.11，表明該提取工藝重復(fù)性好，模型可靠。

2.3 3種茶葉總黃酮含量比較

根據(jù)優(yōu)化后的五棱苦丁茶總黃酮提取工藝，分別對(duì)3種茶葉進(jìn)行總黃酮提取及含量測(cè)定。由圖8可知，苦丁茶、五棱苦丁茶和異葉梁王茶總黃酮含量分別是10.61%、4.98%和15.73%，其中異葉梁王茶總黃酮物質(zhì)最多。

圖7 交互作用的響應(yīng)面圖

2.4 3種茶葉總黃酮體外抗氧化活性

圖8 3種茶葉的總黃酮得率

表4 體外抗氧化活性對(duì)比研究

Table 4 Comparative study on antioxidant activity in vitro

樣品Sample清除率Clearance rate (%)·OH·O-2DPPH·總還原力Total reducing power普通苦丁茶Ilex latifolia39.6126.8469.220.68五棱苦丁茶Ilex pentagona12.3323.9258.520.56異葉梁王茶Nothopanax davidii53.0249.8473.960.79VC55.6594.0699.091.25

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化五棱苦丁茶總黃酮提取工藝，獲得五棱苦丁茶總黃酮提取工藝的最佳組合：超聲波功率316.8 W，超聲頻率35 kHz，乙醇濃度40%，料液比1∶50，提取溫度64.9℃，提取時(shí)間35.2 min。使用最佳提取條件對(duì)苦丁茶、五棱苦丁茶、異葉梁王茶進(jìn)行總黃酮提取，其得率分別為10.61%、4.98%和15.73%。筆者同時(shí)還研究了苦丁茶總黃酮的提取工藝，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，得到苦丁茶總黃酮的最佳提取工藝組合：超聲波功率(411.6 W)，超聲頻率(35 kHz)，乙醇濃度(100%)， 料液比(1∶48.5 g/mL)，提取溫度(68.9℃)，提取時(shí)間(20 min)，此工藝所提取的苦丁茶總黃酮得率為9.02%(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未發(fā)表)。通過(guò)兩個(gè)工藝對(duì)比發(fā)現(xiàn)，采用五棱苦丁茶總黃酮的最佳提取工藝提取苦丁茶總黃酮，其得率可達(dá)10.61%，說(shuō)明五棱苦丁茶總黃酮的最佳提取工藝對(duì)苦丁茶總黃酮的提取也是最優(yōu)的，并確定此提取工藝條件為五棱苦丁茶和苦丁茶的總黃酮的最優(yōu)提取工藝。相對(duì)于張枝等[17]研究苦丁茶超聲提取黃酮工藝(提取時(shí)間1.5 h，提取率2.34%)而言，本工藝提取黃酮的時(shí)間更快(提取時(shí)間35.2 min)，含量更高(提取率10.61%)，顯著地優(yōu)化和提升了超聲波提取苦丁茶總黃酮的工藝水平。延永等[18]采用5種黃酮提取方法對(duì)苦丁茶中黃酮類物質(zhì)的提取效率進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)乙醇回流提取法(12.43%)>超聲波提取法(9.16%)>微波提取法(8.68%)>熱水提取法(6.42%)>堿液提取法(4.63%)；其研究結(jié)果表明乙醇回流提取法提取的含量最高，但是其乙醇回流時(shí)間需要2.5 h，時(shí)間較長(zhǎng)，不利于黃酮的大量提取。本提取工藝較為簡(jiǎn)單，易于操作，提取黃酮的時(shí)間和含量的效益值較高。研究并未驗(yàn)證是否為異葉梁王茶的最佳提取工藝，總黃酮結(jié)果僅為異葉梁王茶的開發(fā)研究提供基礎(chǔ)的黃酮數(shù)據(jù)，對(duì)于異葉梁王茶的提取工藝后期可以深入研究。

4 結(jié)論