兩種培養(yǎng)基對(duì)新生SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響*

漆國(guó)棟 漆 偉 江 瓊 楊 琴 杜岵駿

1 重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院骨科 400010； 2 重慶醫(yī)科大學(xué)，中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)是一種組織特異性干細(xì)胞，發(fā)育上來源于神經(jīng)上皮，分為中樞神經(jīng)干細(xì)胞與外周神經(jīng)干細(xì)胞。兩種細(xì)胞皆具有自我更新和定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能[1-2]。作為干細(xì)胞治療神經(jīng)類疾病中最有前景的細(xì)胞類型，目前的基礎(chǔ)與臨床研究廣泛集中于治療帕金森[3-4]、脊髓損傷[5-6]、腦中風(fēng)[7-8]等疾病。由于數(shù)量及損傷后局部微環(huán)境的影響，單純靠這類細(xì)胞自身增殖修復(fù)的可能性微乎其微[9]。因此采用外源性的神經(jīng)干細(xì)胞移植作用于損傷部位更具有治療效果。本研究針對(duì)新生鼠大腦皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞，比較兩種經(jīng)驗(yàn)培養(yǎng)基，建立一種更優(yōu)的培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料 Neural basal培養(yǎng)基(Gibco，10888022)、B-27(Gibco，A3582801)、Acctuase酶(Gibco，A1110501)、胎牛血清(Gibco，16140071)；bFGF(Peprotech，400-29)、EGF(Peprotech，400-25)；小鼠單克隆抗Nestin抗體(Millipore，MAB353)DyLight488標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(博士德，BA1126)；CCK-8(索來寶，CK04)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：依據(jù)培養(yǎng)過程中使用的兩種不同配方的NSCs增殖培養(yǎng)基，設(shè)立對(duì)照組(Neural basal+2%B-27)與實(shí)驗(yàn)組(DMEM/F12+2%B-27+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF)。

1.2.2 原代培養(yǎng)：取新生24h內(nèi)的SD大鼠，無菌條件下仔細(xì)剝離干凈大腦皮層上的腦膜及血管，眼科鑷前緣解剖分離大腦皮層組織。鋒利剪刀剪成1mm3的小塊。加入適量0.25%胰酶，37℃消化15～20min。胎牛血清終止消化，藍(lán)槍頭均勻用力吹打10～15次，200目細(xì)胞篩過濾形成單細(xì)胞懸液。離心，棄上清液，加適量培養(yǎng)基吹打、重懸。重復(fù)一次離心、重懸步驟。細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×105/ml接種于6cm培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每2～3d半量換液1次, 6～7d傳代1次。

1.2.3 傳代培養(yǎng)：細(xì)胞懸液離心，棄上清液。Acctuase酶吹打、重懸，37℃消化10min。離心，去Acctuase酶，加培養(yǎng)基，均勻用力吹打30～50次，加入適量增殖培養(yǎng)基重懸。傳代后培養(yǎng)方式同原代。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)NSCs初期增殖情況：取相應(yīng)增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的第二代傳代后的單細(xì)胞懸液，隨機(jī)接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為7 000個(gè)，每孔培養(yǎng)基100μl。各組同時(shí)培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入培養(yǎng)基10%體積的CCK-8原液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光度反映細(xì)胞數(shù)情況。每組5孔，重復(fù)3次。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)NSCs整體增殖情況：取相應(yīng)增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的第二代傳代后的單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)7d后接種于多聚賴氨酸包被后的6孔板無菌爬片中培養(yǎng)4h以貼壁。經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5%tritonX-100破膜，10%正常山羊血清封閉后。孵一抗抗Nestin(1∶200)4℃過夜。孵二抗Dylight488標(biāo)記山羊抗小鼠(1∶100)37℃1h。DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片。激光共聚焦下觀，每組隨機(jī)收集4張細(xì)胞爬片進(jìn)行染色，物鏡為20X下按時(shí)鐘的3 點(diǎn)、6點(diǎn)、9 點(diǎn)、12 點(diǎn)和圓心5 個(gè)方位選取5個(gè)視野拍攝照片，并統(tǒng)計(jì)直徑>100μm的神經(jīng)球數(shù)量。統(tǒng)計(jì)同一視野內(nèi)平均直徑。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)形態(tài) 原代細(xì)胞接種后, 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組皆可見分為幾層懸浮的單個(gè)圓形細(xì)胞，邊界清, 折光強(qiáng)，也可能有少量未吹打完全的組織存在。2～3d后,對(duì)照組少部分細(xì)胞成球生長(zhǎng)，大部分仍為單細(xì)胞，死亡細(xì)胞較多，可見較多細(xì)胞碎片(見圖1A)。實(shí)驗(yàn)組見大多數(shù)細(xì)胞顯著增殖呈懸浮聚集成球生長(zhǎng)，單個(gè)神經(jīng)球的直徑不超過50μm，少數(shù)單個(gè)細(xì)胞并見少量死亡的細(xì)胞(見圖1a)。6～7d后，神經(jīng)球通過增殖和融合周圍小的神經(jīng)球變大，其中對(duì)照組神經(jīng)球較小且數(shù)量較少，大多數(shù)大球中心顏色暗淡，營(yíng)養(yǎng)不良(見圖1B)。實(shí)驗(yàn)組單個(gè)神經(jīng)球直徑可達(dá)到150～300μm，多呈球形、桑葚狀，且透光性強(qiáng)(見圖1b)。

圖1 不同培養(yǎng)基及時(shí)間下原代NSCs形態(tài)

A.對(duì)照組原代培養(yǎng)第3天 B.對(duì)照組原代培養(yǎng)第7天 a.實(shí)驗(yàn)組原代培養(yǎng)第3天 b.實(shí)驗(yàn)組原代培養(yǎng)第7天

2.2 初期增殖 CCK-8結(jié)果表明，培養(yǎng)24h、48h、72h后，對(duì)照組OD值各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于實(shí)驗(yàn)組OD值(P<0.05)。通過OD值可表明，實(shí)驗(yàn)組在初期增殖的細(xì)胞數(shù)明顯大于對(duì)照組。具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表1。

表1 CCK-8結(jié)果OD值

2.3 整體增殖 首先，細(xì)胞Nestin表達(dá)呈陽性，證明兩組培養(yǎng)的細(xì)胞皆為NSCs。其次，對(duì)照組的神經(jīng)球數(shù)量為(9.15±3.58)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)球數(shù)量為(20.75±5.06)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。最后，對(duì)照組神經(jīng)球平均直徑為(122.50±40.72)μm，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)球平均直徑為(193.50±29.54)μm，實(shí)驗(yàn)組平均直徑明顯大于對(duì)照組(P<0.05)。代表性圖見圖2。

圖2 免疫熒光圖

綠色熒光標(biāo)記Nestin陽性細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核 A.實(shí)驗(yàn)組，神經(jīng)球形態(tài)正常 B.對(duì)照組，可見部分神經(jīng)球內(nèi)部細(xì)胞開始凋亡無法被Nestin抗體標(biāo)記，呈黑色

3 討論

外源性神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)的來源較多，少部分來源于成體細(xì)胞[10]，大部分以胚胎來源為主，因?yàn)槠涓杉?xì)胞比例較大，細(xì)胞增殖較快[11]。我們往期也選用胚胎來源的細(xì)胞[12-14]，然而多年實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞絕對(duì)量少需要?dú)⑺蓝鄠€(gè)胚胎，血管及腦膜分離難度大，雜質(zhì)細(xì)胞較多，取材過程煩瑣細(xì)胞死亡量大等問題。在查閱近期相關(guān)文獻(xiàn)后[15]，我們決定嘗試更接近胚鼠的24h新生鼠，并選擇適宜培養(yǎng)基。

表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)主要用于維系干細(xì)胞特性的絲裂原[16]。EGF可促進(jìn)長(zhǎng)期存活，而bFGF可對(duì)分化起一定作用[17]。當(dāng)它們共同添加到培養(yǎng)基時(shí)可促進(jìn)分裂增殖并且抑制分化，其作用與兩者濃度呈協(xié)同關(guān)系，20ng/ml時(shí)其促分裂作用最強(qiáng)[18]。不含生長(zhǎng)因子的Neurobasal培養(yǎng)基已被我們證明適用于胎鼠來源。因此我們猜測(cè)，針對(duì)新生鼠來源，不含生長(zhǎng)因子的Neurobasal培養(yǎng)基與含生長(zhǎng)因子的DMEM∶F12培養(yǎng)基二者是否存在差異，哪種培養(yǎng)基更適合新生鼠來源。

巢蛋白(Nestin)被認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白之一，被廣泛應(yīng)用于鑒定，因?yàn)橹灰?xì)胞開始向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化時(shí)，該蛋白便會(huì)停止表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)分析與Nestin鑒定表明兩種培養(yǎng)基皆可成功培養(yǎng)出新生鼠大腦皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞。通過CCK-8與神經(jīng)球數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，含有因子的培養(yǎng)基更能促進(jìn)細(xì)胞的增殖?？傮w上說，本實(shí)驗(yàn)旨在建立一套成熟的新生鼠大腦皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)體系，提供具有良好增殖與活性的神經(jīng)干細(xì)胞，為之后進(jìn)一步的相關(guān)增殖、凋亡、分化、移植等實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。