高效液相-高分辨飛行時間質(zhì)譜對復(fù)方夏枯草消瘤方化學(xué)成分的鑒別

戴媛媛，汪曉河，馬明華，計強國，顧小燕，吳鐵軍，年 華 （.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 00437；.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 00090）

夏枯草消瘤合劑由中藥夏枯草、牡蠣、生地黃、莪術(shù)、蒼術(shù)、白術(shù)組成，是中醫(yī)腫瘤學(xué)專家錢伯文教授的經(jīng)驗方。方中諸藥配伍，以達化痰軟堅，活血化瘀，補養(yǎng)氣血的功效。其臨床實驗研究已證實，該藥配合一線化療方案治療中晚期非小細胞肺癌患者，有助于提高患者的生存治療和減少化療所產(chǎn)生的毒副作用[1]。由該方制成的合劑在我院臨床使用多年，前期研究對于組方中化學(xué)成分的研究仍限于迷迭香酸、咖啡酸的穩(wěn)定性研究[2]。盡管方中一些單味藥的化學(xué)成分已有報道[3-18]，但是整個復(fù)方制劑的化學(xué)成分未見報道。由于組分的復(fù)雜性，復(fù)方的成分分析比單味藥更具有挑戰(zhàn)性，明確夏枯草消瘤方色譜圖中各個色譜峰歸屬對于該復(fù)方的質(zhì)量控制及體內(nèi)深入研究具有重要意義。

高效液相-高分辨飛行時間質(zhì)譜（HPLCTOF/MS）串聯(lián)技術(shù)對于中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分分析和鑒定非常有效。其靈敏度高、操作簡便、耗時短，可以在短時間獲得化合物準(zhǔn)確的相對分子質(zhì)量，通過與所建立的已知化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫比對，可以快速的對被測成分進行分析鑒別[19-20]。因此，本文采用HPLC-TOF/MS 技術(shù)，首次對夏枯草消瘤方中化學(xué)成分進行鑒別，并且對各成分進行藥材歸屬，以進一步闡明夏枯草消瘤方的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器

Agilent 1100 系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和二級管陣列檢測器；Agilent 6220 高分辨飛行時間質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司），配有標(biāo)準(zhǔn)電子噴霧離子源（ESI）；分析軟件為 MassHunter 數(shù)據(jù)采集在線工作站和Qualiative Analysis 離線分析軟件。

1.2 藥品與試劑

咖啡酸（批號：110885-200102，純度＞98.5%）、迷迭香酸（批號：111871-201505，純度＞98.5%）對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇和甲酸為色譜純（Fisher，USA），其余試劑均為分析純，水為純水。

夏枯草、生地黃、莪術(shù)、麩炒蒼術(shù)、麩炒莪術(shù)、牡蠣、煅牡蠣均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供（見表1）。藥材及飲片均經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室黃寶康教授鑒定。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取咖啡酸、迷迭香酸對照品3.22、5.68 mg 置10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋定容，配成濃度分別為322、568 μg/ml 的母液，精密吸取母液1 ml 置于 10 ml 量瓶，加甲醇定容后，即得對照品溶液。

表 1 藥材信息

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取夏枯草4.2 g、牡蠣8.4 g、煅牡蠣8.4 g、地黃4.2 g、莪術(shù)4.2 g、白術(shù)（麩炒）2.1 g、蒼術(shù)（麩炒）2.1 g，以上七味，充分潤濕，分別加8 倍量與4 倍量水煎煮兩次，每次煮沸后于85 ℃保溫20 min，煎液濾過，合并濾液，濾液濃縮至相對密度1.10 以上（80 ℃），離心，取上清液；精密吸取夏枯草消瘤方溶液上清液5 ml，置于50 ml 容量瓶中，加甲醇定溶，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得夏枯草消瘤方樣品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：ACE C18（3.0 mm×150 mm），流動相A 相為甲醇，B 相為水（含0.1%甲酸），梯度洗脫：0～5 min：5%A，5～10 min：5%～15%A，10～30 min：15%～45%A，30～40 min：45%～70%B，40～50 min：70%～90%B；進樣量2 μl，流速為0.4 ml/min；柱溫為25 ℃；運行時間為50 min。

2.4 質(zhì)譜條件

采用ESI 離子源，正、負離子模式均進行檢測，霧化器為高純氮氣，具體參數(shù)如下：正離子模式：毛細管電壓3500 V，干燥器溫度350 ℃，干燥器流速10L/min，霧化器壓力40 psig，碎片電壓160 V；參比離子m/z121.9856，1033.9881；掃描范圍m/z100-1200。測定樣品之前，使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，以保證質(zhì)量精度誤差小于1×10-6。

2.5 夏枯草消瘤方化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫的建立

根據(jù)國內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)庫中科院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫、Pubmed、Chemspider 等，以及國內(nèi)外相關(guān)研究文獻，收集了夏枯草消瘤合劑方中六味中藥化學(xué)成分名稱及分子式共760 個。采用安捷倫“formuladatabase generator”軟件（含各元素精確質(zhì)量數(shù)），根據(jù)各成分碳、氫、氧的個數(shù)，計算精確相對分子質(zhì)量、M+H 和M-H 準(zhǔn)分子離子峰相對分子質(zhì)量的相應(yīng)的化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。

3 結(jié)果和討論

3.1 夏枯草消瘤合劑的相關(guān)圖譜

夏枯草消瘤方樣品溶液的總離子流圖見圖1。其中圖1A 為正離子160 V 模式，圖1B 為負離子160 V 模式，圖1C 為負離子260 V 模式。

3.2 利用對照品鑒別化合物

實驗中利用已有的2 個對照品，在負離子模式、碎片電壓160 V 條件下，無偏差的鑒別出咖啡酸、迷迭香酸，對照品總離子流圖見圖2。

3.3 利用精確質(zhì)量數(shù)和同位素分布鑒別化合物

正離子模式下以圖1 中2 號峰疣孢酚為例，說明夏枯草消瘤方色譜峰的鑒別過程。保留時間為24.032 min，色譜圖中的準(zhǔn)分子離子為267.1591。利用Qualiative Analysis 數(shù)據(jù)分析軟件的計算功能計算精確質(zhì)量數(shù)的可能元素組成（5×10-6），并比對數(shù)據(jù)庫中已知化合物的質(zhì)荷比，初步確定元素組成為C15H22O4，為疣孢酚的(M+H)+。計算該準(zhǔn)分子離子的核素分布情況，從圖3A 可以看出同位素分布的理論值（方框所示）與實際值（方框內(nèi)峰所示）吻合良好，確定此峰為疣孢酚。同理可得負離子模式下圖1 中18 號峰，地黃苷D 的解析過程（圖3B）。

圖 1 夏枯草消瘤方 TOF/MS 總離子圖

圖 2 對照品 TOF/MS 總離子流圖

圖 3 夏枯草消瘤方同位素分布圖

3.4 夏枯草消瘤合劑化學(xué)成分鑒別結(jié)果

根據(jù)飛行時間質(zhì)譜測得精確的相對分子質(zhì)量，比對所建立的數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Qualiative Analysis 質(zhì)譜分析軟件計算分子組成，將理論值與實測值進行比對，結(jié)合上述對照品鑒別結(jié)果及相關(guān)文獻報道，對夏枯草消瘤合劑中藥材在正、負離子模式下所得色譜圖中色譜峰進行分析，初步鑒別出37 個化學(xué)成分，結(jié)果見表2、表3。對于部分未見區(qū)分的同分異構(gòu)體，后期可考慮調(diào)節(jié)碎片電壓獲得化合物的裂解規(guī)律進行區(qū)分。

3.5 討論

對色譜條件的摸索，考察了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)甲醇的洗脫效果優(yōu)于乙腈，且各色譜峰分離效果更好，加入0.1%甲酸可以改善峰型，并提高質(zhì)譜響應(yīng)，故采用甲醇-0.1%甲酸水為流動相。由于本組方含有藥材較多，組方內(nèi)所含成分比較復(fù)雜，因此選擇大梯度洗脫，以期最大程度地得到其中的化合物保留。質(zhì)譜檢測比較了正、負離子兩種掃描模式，由于組方中所含多種化合物響應(yīng)模式各有不同，因此，選擇正、負離子兩種掃描模式同時進行監(jiān)測。對于碎片電壓的選擇，本方中大部分化學(xué)成分在160 V 時以準(zhǔn)分子離子峰形式穩(wěn)定存在，有少量化學(xué)成分在負離子模式下260V 時以準(zhǔn)分子離子峰形式穩(wěn)定存在，圖譜本底較低，因此選擇160 V、260 V 的碎片電壓可以最大限度地對復(fù)方中的成分進行鑒別。

4 結(jié)論

本研究運用 HPLC-TOF/MS 技術(shù)快速鑒別夏枯草消瘤合劑中37 種化學(xué)成分，其中正離子模式碎片電壓160 V 條件下8 個；負離子模式碎片電壓160 V 條件下28 個，碎片電壓260 V 條件下19 個；正負離子均有響應(yīng)4 個，負離子模式兩種碎片電壓下均有響應(yīng)16 個，并對成分進行了藥材歸屬。該方法在傳統(tǒng)的植物化學(xué)分離提取基礎(chǔ)上對色譜峰進一步明確化，為夏枯草消瘤方的質(zhì)量控制、體內(nèi)的深入研究及臨床應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

表 2 夏枯草消瘤合劑中化學(xué)成分的正離子模式鑒別結(jié)果

表 3 夏枯草消瘤合劑中化學(xué)成分的負離子模式鑒別結(jié)果