藏藥止瀉木子揮發(fā)油超臨界提取工藝、GC-MS分析及抑菌活性研究

南措吉，李毛加，張金魁，扎西吉，南杰東智，才讓南加

( 1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，中國(guó) 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 西寧 810007；3.青海省玉樹州藏醫(yī)院，中國(guó) 玉樹 815099)

止瀉木子SEMEN HOLARRHENAE(藏語稱“土膜鈕”)為傳統(tǒng)藏藥藥用植物，是夾竹桃科植物止瀉木HolarrhenaantidysenteriacaWall. ex A. DC.的干燥種子[1,2]，屬常用藏藥品種，味極苦，性涼，治所有赤巴熱癥，尤其對(duì)膽囊熱癥和熱型痢疾腸道蟲病有奇效[3]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)止瀉木子中含有錐絲堿、異錐絲明、錐絲亞胺等多種生物堿類成分[4]。止瀉木子科屬植物具有抗菌、消炎等活性[5]。耿金峰[5，6]等發(fā)現(xiàn)止瀉木子粗提物和總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等6個(gè)菌種有明顯的抑菌作用，且總生物堿對(duì)細(xì)菌的抑制作用優(yōu)于粗提物，但是未見對(duì)止瀉木子的揮發(fā)油提取工藝和其抑菌活性的相關(guān)研究。為此，本文對(duì)藏藥止瀉木子揮發(fā)油提取工藝及其抑菌活性開展了相關(guān)研究工作，并利用GC-MS分析了揮發(fā)油主要化學(xué)成分。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

7071型超臨界CO2萃取儀，Series1500夾帶劑泵、萃取釜、空壓機(jī)和SDC-6冷循環(huán)水系統(tǒng)；GC/MS聯(lián)用：美國(guó)Agilent公司7890A/MSD5975C；Agilent公司G1888頂空進(jìn)樣器；四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器；質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫：NIST08 MS search 2.0；MSD Chemstation D.03.00.611色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；Applied Separations(美國(guó)分離技術(shù)公司)。

1.2 試藥

止瀉木子(購買于青海省西寧市八一路藥材市場(chǎng)，經(jīng)青海民族大學(xué)藥學(xué)院才讓南加教授確認(rèn)為印度止瀉木子)。

1.3 菌株

甲型副傷寒沙門菌Salmonellaparatyphi-A，宋氏志賀氏菌Shigellasonnei， 金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus,短小芽孢桿菌Bacilluspumilus,藤黃微球菌Micrococcusluteus，乙型副傷寒沙門菌SalmonellaparatyphyB，痢疾志賀氏菌Shigelladysenteriae，銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa，大腸埃希菌Escherichiacoli，產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes，蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus，白色念珠菌Candidaalbicans,黑曲霉Aspergillusniger，釀酒酵母菌SaccharomycescerevisiaeHansen。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SFE-CO2萃取實(shí)驗(yàn)方法

將止瀉木子粉碎，過0.18～0.25 mm篩使粒度一致，稱取止瀉木子粉末，每個(gè)萃取釜中加入28.0 g樣品，將萃取釜連接到萃取裝置中。加熱使萃取釜達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)定溫度，通入二氧化碳檢查密閉性，如氣密性完好則進(jìn)行加壓萃取。靜態(tài)萃取15 min后動(dòng)態(tài)萃取并收集揮發(fā)油。以萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間為考察因素,見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2.2 GC-MS分析

氣質(zhì)聯(lián)用條件： 氣相色譜柱為HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×250 μm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度條件為250 ℃，輔助區(qū)溫度條件280 ℃；采用手動(dòng)進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量10 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次；分流比為20∶1；載氣為(流量)He (0.8 μL·min-1)；程序升溫條件：起始溫度為40 ℃，持續(xù)5 min。以3 ℃·min-1升溫至40 ℃，運(yùn)行時(shí)間為5 min，保持5 min；以2 ℃·min-1升溫至280 ℃，運(yùn)行時(shí)間為70 min，恒溫保持570 min；質(zhì)譜檢測(cè)器條件為：FID溫度設(shè)定條件為250 ℃，電離方式EI：70 eV；掃描范圍為m/z：50～550 amu；質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫為NIST08 MS search 2.0 數(shù)據(jù)庫。

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

取1 μL超臨界萃取的止瀉木子揮發(fā)油樣品融入1 mL DMSO溶劑中備用。前期制備好pH7.2～7.4的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，通過紫外滅菌25 min后接種14個(gè)不同菌種，30～35 ℃ 培養(yǎng)24 h，制備1011cfu·L-1的孢子懸液，測(cè)定樣品和陽性對(duì)照品、陰性(空白)對(duì)照品的抑菌圈大小。

3 結(jié)果與分析

3.1 止瀉木子揮發(fā)油提取工藝研究

超臨界CO2萃取止瀉木子揮發(fā)油工藝參數(shù)的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從分析結(jié)果可知, 萃取壓力、溫度、時(shí)間三因素的方差值分別為1.38，1.33和1.23, 表明萃取壓力對(duì)揮發(fā)油萃取率影響最顯著，影響從大到小的順序?yàn)檩腿毫?、萃取溫度、萃取時(shí)間，見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

本研究以止瀉木子為研究對(duì)象，通過提取工藝的篩選，確定了該藥揮發(fā)油的超臨界CO2最佳萃取工藝參數(shù)為萃取壓力25 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時(shí)間2.3 h。在此條件下萃取揮發(fā)油平均得率為6.8%。

3.2 止瀉木子揮發(fā)油主要化學(xué)成分鑒定

通過GC-MS對(duì)止瀉木子揮發(fā)油進(jìn)行分析測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒定，總共分離出可識(shí)別峰119個(gè)，確定了10種含量較高的化學(xué)成分，其中十二甲基環(huán)六硅氧烷保留指數(shù)高且含量在22%以上，為止瀉木子揮發(fā)油中的主要成分之一，見表3。

表3 止瀉木子中揮發(fā)油主要化學(xué)成分

3.3 止瀉木子揮發(fā)油抑菌作用研究

通過觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，發(fā)現(xiàn)止瀉木子揮發(fā)油對(duì)14個(gè)菌種有不同程度的抑菌效果，其抑菌情況如表4所示。

表4 止瀉木子提取物對(duì)不同菌種的抑菌情況

注：+表示有抑菌圈，-表示沒有抑菌圈。

止瀉木子揮發(fā)油對(duì)上述5種細(xì)菌有不同程度的抑菌作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、宋氏志賀氏菌和短小芽孢桿菌的抑菌率分別為82.8%，64%及40.7%，表示在相同的濃度下止瀉木子對(duì)金色葡萄球菌的抑菌效果較好，見表5。相同濃度下止瀉木子對(duì)白色念珠菌和黑曲霉的抑菌效果較好，但是對(duì)釀酒酵母菌無抑菌作用，見表6。

表5 止瀉木子揮發(fā)油對(duì)11種細(xì)菌的抑菌效果

注：A 陽性對(duì)照物為氨芐青霉素鈉，B陽性對(duì)照物為硫酸慶大霉素。

表6 止瀉木子揮發(fā)油對(duì)3種真菌的抑菌效果

4 討論

通過前期對(duì)提取條件的摸索發(fā)現(xiàn)，止瀉木子中的揮發(fā)油很難用水蒸氣蒸餾，相比之下，超臨界二氧化碳萃取法(SFE-CO2)提取止瀉木子揮發(fā)油具有速度快、產(chǎn)油率高等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用SFE-CO2萃取，在萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為2.3 h的條件下得油率最高，是最優(yōu)萃取條件。GC-MS分析發(fā)現(xiàn)止瀉木子揮發(fā)油中化學(xué)成分種類少，但相對(duì)含量較高。

《晶鏡本草》[3,7]記載止瀉木子對(duì)熱性痢疾具有特效，而熱性痢疾在患者癥狀表現(xiàn)上與細(xì)菌感染性腹瀉高度相似，臨床上細(xì)菌感染性腹瀉按熱性痢疾診治。熱性痢疾在臨床上以發(fā)熱、腹痛、腹瀉、里急后重及排含黏液、膿血的稀便為主要癥狀。通過抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藏藥止瀉木子對(duì)細(xì)菌和真菌均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌和宋氏志賀氏菌的抑菌效果最強(qiáng)，而臨床上細(xì)菌性感染的腹瀉患者中，金黃色葡萄球菌和志賀氏菌感染者多見[9-12]。江華超[13]等通過研究病理切片觀察發(fā)現(xiàn)志賀氏菌對(duì)小鼠具有很強(qiáng)的致病作用，該菌會(huì)引發(fā)多種器官及腸道充血或出血。喜杰[14]等對(duì)止瀉木子的藥理研究發(fā)現(xiàn)以止瀉木子為主的方劑在小鼠實(shí)驗(yàn)中對(duì)治療腹瀉效果顯著。由此筆者推測(cè)止瀉木子治療熱性痢疾的機(jī)制可能是通過抑制葡萄球菌和志賀氏菌來起效，這有待進(jìn)一步驗(yàn)證。