安卡紅曲霉液態(tài)發(fā)酵豆渣、麥麩、梨渣制備可溶性膳食纖維

孫聰聰 李興江,2 穆冬冬,2 陳小舉 劉淑蕓 張 旻,2 潘麗軍,2 姜紹通,2 鄭 志,2 陳明鑫 吳學鳳,2

(1. 安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009；2. 合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；3. 巢湖學院化學與材料工程學院，安徽 巢湖 238000)

膳食纖維(dietary fiber，DF)對促進消化和排泄具有重要作用[1]。DF包括可溶性膳食纖維(SDF)和不溶性膳食纖維(IDF)，其中SDF具有更優(yōu)的功能特性[2]。酸法、堿法、酶法、發(fā)酵法等是制備SDF的常見方法。酸法和堿法成本低，操作簡單，但反應時間長，并會有大量化學殘留；酶法制取效果好，可顯著提高SDF含量，但成本高，條件嚴苛，難以實現規(guī)模化生產；發(fā)酵法是通過微生物對原料中植酸、大分子多糖、蛋白質等的發(fā)酵降解作用來改性DF，制備的SDF品質好，且反應過程易于控制和調節(jié)，是一種前景良好的SDF制取方法[3]。Chu等[4]采用納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)發(fā)酵小米糠，所得SDF與IDF的比例從3.1%增加至19.9%。Jia等[5]利用綠色木霉(Trichodermaviride)發(fā)酵脫脂米糠，SDF產率從10.5%增加至33.4%，發(fā)酵后脫脂米糠的SDF具有更大的潛力，可用作食品中的功能成分。

安卡紅曲霉是紅曲霉的一種，在生長過程中能產生多種活性物質，如monacolin K、麥角固醇、紅曲色素、酶等[6]。紅曲霉發(fā)酵會產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和木聚糖酶等多種降解酶[7]，發(fā)酵液中豐富的蛋白酶和淀粉酶會水解附著在多糖分子表面的蛋白質和淀粉上，增加多糖分子與纖維素酶和木聚糖酶的接觸位點，從而增加底物中的膳食纖維含量。而發(fā)酵液中的纖維素酶和木聚糖酶活性較高，可使膳食纖維中纖維素和半纖維素氫鍵斷裂，分子鏈減小，寡糖含量增加[8]。試驗擬探索安卡紅曲霉在液態(tài)發(fā)酵過程中代謝產物對豆渣、麥麩、梨渣SDF的得率和水合性能的影響，為解決農產品廢渣處理和制備高品質豆渣、麥麩、梨渣SDF提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

豆渣、麥麩、梨渣：每100 g豆渣的碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量分別為61.00，16.50，11.22，3.98，7.30 g；每100 g麩皮的碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量分別為63.40，16.19，9.25，4.16，7.00 g;每100 g梨渣的碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量分別為62.40，12.10，13.85，4.77，6.88 g，所有化學試劑均為國產分析純。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

安卡紅曲霉(Monascusanka)3.4811：中國通用微生物菌種保藏中心，保存于合肥工業(yè)大學安徽省農產品加工重點實驗室；

活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；

種子培養(yǎng)液：3%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.1%七水合硫酸鎂、0.3%磷酸氫二鉀、100 mL蒸餾水，pH 7.0， 121 ℃滅菌20 min；

發(fā)酵培養(yǎng)液：取麥麩、豆渣、梨渣粉200 g，葡萄糖10 g，硫酸銨4 g，用蒸餾水定容1 000 mL，250 mL三角瓶分裝100 mL發(fā)酵液，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設備

超聲波清洗儀：GT SONIC-P27型，廣東固特超聲股份有限公司；

冷凍高速離心機：5804R型，德國Eppendorf公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：HNY-100Y型，恒立國際有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH2S4型，北京科偉永興儀器有限公司；

分光光度計：721型，上海菁華科技儀器有限公司；

電子天平：FA2004B型，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 可溶性膳食纖維的制備

(1) 水提法：分別稱取10 g廢渣粉，加100 mL水，搖勻后靜置90 min，超聲波處理30 min，8 000 r/min離心15 min，收集上清液，加入4倍體積95%乙醇，4 ℃醇沉過夜，離心(8 000 r/min，15 min)，將沉淀復溶，冷凍干燥得SDF。

(2) 酶法：根據文獻[9]略作修改，分別稱取10 g廢渣粉，加100 mL水進行水浴浸提，95 ℃下加入耐高溫α-淀粉酶至上清液碘液測定不變藍后，冷卻至60 ℃加入適量糖化酶反應30 min，再向溶液中加入堿性蛋白酶繼續(xù)反應30 min，繼續(xù)加入纖維素酶和木聚糖酶分別于45，55 ℃下水浴30 min，反應結束后，后續(xù)方法同水提法。

(3) 發(fā)酵法：根據文獻[10]略作修改，將發(fā)酵培養(yǎng)基高溫滅菌后，按一定比例接入紅曲霉種子培養(yǎng)液，于28 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)一定時間后，8 000 r/min離心15 min，后續(xù)方法同水提法，分別得豆渣可溶性膳食纖維(OSDF)、麥麩可溶性膳食纖維(BSDF)、梨渣可溶性膳食纖維(PSDF)。

1.2.2 SDF得率的計算 按式(1)計算SDF得率。

(1)

式中：

C——SDF得率，%；

M1——干燥培養(yǎng)皿質量，g；

M2——醇沉后凍干的盛有SDF的培養(yǎng)皿質量，g；

M——底物的干質量，g。

1.2.3 單因素試驗 以SDF得率為評價指標，分別考察料液比[1∶5～1∶25 (g/mL)]、接種量(6%～14%)、發(fā)酵時間(3～7 d)對紅曲霉發(fā)酵法制備BSDF、OSDF、PSDF的影響。

1.2.4 多因素優(yōu)化試驗 在單因素試驗結果的基礎上，選擇對試驗指標影響顯著的因素水平分別進行正交試驗和響應面優(yōu)化試驗，以確定較優(yōu)的制備條件。

1.2.5 SDF性質的測定 根據文獻[11-12]的方法分別測定SDF的持水性(WHC)和持油性(OHC)。將0.1 g SDF樣品溶于試管中，充分振動搖勻，490 nm處測定其吸光度，以觀察SDF的透明度。

根據美國農業(yè)部 （USDA）11月報告，由于伊利諾伊州、艾奧瓦州兩大大豆主產地減產，2018/2019年度大豆預計單產從53.1蒲式耳/畝下調至52.1蒲式耳/畝，預計產量由上月的1.28億噸下調至1.25億噸。盡管預計產量在本月報告中有所下調，但總體增長較為穩(wěn)定，比去年高出4%，再度創(chuàng)歷史新高。

1.3 統(tǒng)計分析

所有試驗重復3次，使用SPSS V19.0軟件進行統(tǒng)計分析。使用Duncan檢驗，P<0.05表示統(tǒng)計學顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對SDF得率的影響 由圖1可知，料液比影響紅曲霉發(fā)酵法制備OSDF、BSDF、PSDF的得率，對OSDF得率的影響大于BSDF和PSDF的。SDF得率隨料液比的增加先增大后趨于穩(wěn)定。當料液比為1∶5 (g/mL)時，OSDF得率最低，由于豆渣吸水性較高，當料液比較低時，溶液黏度大，不利于菌絲體的生長。當料液比為1∶15 (g/mL)之后，SDF得率的增長趨勢變緩。制備SDF需消耗大量的無水乙醇進行醇沉，為節(jié)約成本、降低乙醇回收處理量，確定豆渣、梨渣和麩皮的較佳料液比為1∶15 (g/mL)。

圖1 料液比對SDF得率的影響

Figure 1 Effect of material-liquid ratio on SDF extraction

2.1.2 接種量對SDF得率的影響 由圖2可知，SDF得率隨接種量的增加先增加后有所降低，最后趨于穩(wěn)定。接種量過少時，菌濃度太低，代謝產物少，SDF得率較低；接種量繼續(xù)增大時，安卡紅曲霉菌體量過多，培養(yǎng)液黏度增加，供氧不足，后期紅曲霉生長所需營養(yǎng)不足，SDF得率有所降低[13-14]，故最佳接種量為12%。

2.1.3 發(fā)酵時間對SDF得率的影響 由圖3可知，發(fā)酵5 d時，BSDF和PSDF得率最高；發(fā)酵6 d時，OSDF得率最高。發(fā)酵初期，紅曲霉對農產品廢渣中的IDF進行降解，使IDF的糖苷鍵斷裂，生成小分子糖轉化為SDF，更多的大分子物質得以分解；發(fā)酵一定時間后，SDF得率下降，可能是發(fā)酵一段時間后，基質被消耗，無法提供紅曲霉菌增殖所需的營養(yǎng)物質[15]，微生物開始利用小分子糖，SDF被進一步分解為分子量更小的組分，不易提取。

圖2 接種量對SDF得率的影響

圖3 發(fā)酵時間對SDF得率的影響

2.2 多因素試驗結果

2.2.1 BSDF發(fā)酵條件優(yōu)化 以料液比、接種量、發(fā)酵時間為因素，以SDF得率為考察指標設計正交試驗，因素水平表見表1，試驗結果及分析見表2。

由表2可知，BSDF制備工藝各因素的主次順序是料液比>接種量>發(fā)酵時間，較優(yōu)組合為A2B3C2。由表3可知，料液比和接種量對BSDF得率影響顯著，發(fā)酵時間對其影響不顯著，較優(yōu)組合為A2B3C1。對上述兩種組合進行驗證實驗(n=3)，A2B3C2得率為5.52%，A2B3C1得率為5.38%。因此紅曲霉發(fā)酵制備BSDF較優(yōu)條件為發(fā)酵時間6 d，料液比為1∶15 (g/mL)，接種量14%。

表1 正交試驗設計因素水平表

表2BSDF制備工藝正交試驗設計及結果分析

Table2OrthogonaltestdesignsandresultsanalysisofBSDFpreparationprocess

試驗號ABC空列SDF得率/%111111.70212222.70313333.25421233.80522314.16623124.80731323.00832133.30933214.00K17.658.509.809.86K212.7610.1610.5010.50K310.3012.0510.4110.35R5.113.550.610.64

2.2.2 PSDF發(fā)酵條件優(yōu)化 以料液比、接種量、發(fā)酵時間為因素，以SDF得率為考察指標設計正交試驗，因素水平表見表4，試驗結果及分析見表5。

由表5可知，PSDF制備工藝各因素的主次順序是發(fā)酵時間>料液比>接種量，較適組合為A3B3C2。由表6可知，發(fā)酵時間和料液比對PSDF得率影響顯著，接種量對其影響不顯著，較適組合為A3B3C2，對該組合進行驗證實驗(n=3)，SDF得率為5.42%。故紅曲霉發(fā)酵制備PSDF較優(yōu)條件為發(fā)酵時間6 d，料液比1∶20 (g/mL)，接種量14%。

2.2.3 OSDF發(fā)酵條件優(yōu)化 以料液比、接種量、發(fā)酵時間為因素，以SDF得率為考察指標設計響應面試驗，因素水平表見表7，試驗結果及分析見表8。

采用Box-Behnken進行多元回歸擬合分析，得二次多項回歸方程：

Y=8.03-0.26A+0.18B+0.29C+0.12AB-0.065AC+0.43BC-1.93A2-0.52B2-1.43C2。

(2)

利用回歸方程對制備OSDF的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，可預測OSDF得率的變化[16]。由表9可知，回歸模型極顯著，表明與實際情況擬合度好；失擬項不顯著，表明殘差均由隨機誤差引起，對試驗干擾小。3個因素對OSDF得率的影響依次為發(fā)酵時間>料液比>接種量，制備OSDF的較優(yōu)條件為料液比1∶14.67 (g/mL)、接種量13%、發(fā)酵時間6.83 d，根據實際情況修正為發(fā)酵時間7 d、料液比1∶15 (g/mL)、接種量13%，進行驗證實驗(n=3)。OSDF得率為8.3%，接近預測值(8.03%～8.50%)，說明采用響應面設計得到的工藝參數真實可信，有較好的指導意義。

表3BSDF制備工藝的方差分析

Table3AnalysisofvarianceanalysisofBSDFpreparati-onprocess

表4 正交試驗設計因素水平表

表5PSDF制備工藝正交試驗設計及結果分析

Table5OrthogonaltestdesignandresultsanalysisofPSDFpreparationprocess

試驗號ABC空列SDF得率/%111113.00212224.44313333.58421234.85522314.39623124.0073134.20832133.80933215.40K111.0212.0510.8012.79K213.2412.6314.6912.64K313.4012.9812.1712.23R2.380.933.890.56

2.3 SDF成分及功能特性分析

由表10可知，發(fā)酵法和酶法能顯著提高SDF得率，且3種底物發(fā)酵法SDF得率均大于酶法。發(fā)酵法與水提法相比，蛋白質與脂肪含量降低，即紅曲霉在生長過程中利用底物營養(yǎng)成分，得到更高純度的SDF。經紅曲霉發(fā)酵后提取的OSDF、BSDF和PSDF的透明度、持水力、持油力都有較明顯提高。高透明度說明SDF溶解度高，高持水力和持油力是SDF功能特性的良好體現[17]。由于發(fā)酵過程中紅曲霉產生的纖維素酶、木聚糖酶等[18]使聚合度高的豆渣、麥麩、梨渣中纖維部分降解成結構松散的小顆粒SDF[19]，增加了溶液與SDF的接觸面積，提高了WHC和OHC[20-21]，SDF溶于水后形成膠體。因此，SDF純度越高，含量越大，持水性越好；發(fā)酵過程中，脂肪含量減少，多糖細胞壁被破壞，膳食纖維空隙增多，有利于提高OHC[22]。故紅曲霉發(fā)酵可有效提高豆渣、麥麩、梨渣SDF的理化性質，是改性豆渣、麥麩、梨渣SDF的有效途徑。

表6PSDF制備工藝的方差分析

Table6AnalysisofvarianceanalysisofPSDFpreparati-onprocess

差異源平方和df均方F值顯著性A1.18020.59021.07*B0.14720.0742.64C2.59521.29846.36*誤差0.05620.028總計3.9788

表7響應面試驗設計因素水平編碼表

Table7Responsesurfacetestdesignfactorlevelcodingtable

水平A料液比(g/mL)B接種量/%C發(fā)酵時間/h-11∶1010501∶1512611∶20147

表8OSDF制備工藝Box-Behnken試驗設計及結果分析

Table8Box-BehnkentestdesignandresultanalysisofOSDFpreparationprocess

試驗號ABCSDF得率/%11014.5320-1-16.0630008.034-1015.45510-14.0260008.047-1105.7580008.0390008.03100008.0311-10-14.68120116.96131105.74141-105.17150-115.7216-1-105.671701-15.58

表9 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗?

? **極顯著(P<0.01);*顯著(P<0.05)。

表10 紅曲霉發(fā)酵不同底物制備SDF的成分及性質?

? 同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

采用安卡紅曲霉3.4811對農產品廢渣進行發(fā)酵，得到最優(yōu)發(fā)酵條件：豆渣發(fā)酵時間7 d、料液比1∶15 (g/mL)、接種量13%；麥麩發(fā)酵時間6 d、料液比1∶15 (g/mL)、接種量14%；梨渣發(fā)酵時間6 d、料液比1∶20 (g/mL)、接種量14%。結果表明，紅曲霉發(fā)酵可顯著提高SDF得率。紅曲霉發(fā)酵后，SDF純度更好，具有良好的溶解度、持水力和持油力。與其他方法制備OSDF、BSDF和PSDF相比，紅曲霉發(fā)酵法優(yōu)勢明顯，可廣泛應用于食品工業(yè)。后續(xù)可對紅曲霉發(fā)酵制備SDF的組分及結構特征進行深入研究，結合紅曲霉代謝途徑的調控策略研究，進一步提升紅曲膳食纖維的品質，為其在食品中的應用提供基礎。