大豆灰霉病和黑斑病拮抗菌株的篩選和鑒定

吉 麗，田 磊，盧寶慧，田春杰

(1.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，吉林 長春 130102；2.中國科學院大學，北京 100049；3.吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130117)

0 引 言

大豆是我國重要的糧油兼用作物，在種植業(yè)結(jié)構(gòu)中占有重要地位[1]。大豆病害中以真菌病害為主[2]。其中，葡萄孢屬真菌(Botrytiscinerea)可引起豆科、茄科、葫蘆科及薔薇科等400余種植物患灰霉病[3-4]，當大豆感染灰霉病時，葉片初期會出現(xiàn)小褐色病斑，隨后逐漸發(fā)展成周邊褐色、中部灰色或灰褐色的圓形或橢圓形以及其他不規(guī)則形狀的病斑[5]。而半知菌亞門鏈格孢真菌(Alternariasp.)不僅會在大豆整個生長時期侵染大豆植株，引起大豆黑斑病病害，在人參、柑橘、甘藍、棗果、黃瓜及月季等植物上均具有致病性[6-11]。從已有的報道得知，大豆灰霉病在北方居多，而大豆黑斑病在吉林省、遼寧省、黑龍江省、江蘇省及四川省等省份均有發(fā)生[12]。雖然我國耕地面積只有全世界的8%，但化學農(nóng)藥用量卻占全球35%，位居世界第一[13]，而目前控制大豆灰霉病和黑斑病的主要方法仍是以化學殺菌劑為主。化學農(nóng)藥雖在短時間內(nèi)會產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益，但隨著時間推移它所引起的諸多問題也日益顯現(xiàn)[14]。鑒于農(nóng)殘隱患以及綠色有機農(nóng)業(yè)發(fā)展需求，生防菌劑的開發(fā)和應(yīng)用迫在眉睫。其中部分生防菌如多粘類芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、假單胞菌、以及酵母菌、木霉菌和鏈霉菌等良好的生防效果已得到驗證[15-20]，并且對植物的生長還有一定促進作用。

在不同病原菌引起的植物侵染性病害中，約有70%的病害是由真菌引起的[21]。而真菌細胞壁的3%～60%是由幾丁質(zhì)構(gòu)成的[22]。因此，本研究以篩選分解真菌細胞壁的重要成分幾丁質(zhì)為出發(fā)點，利用平板對峙法進一步篩選對大豆灰霉病和黑斑病有抑制作用的拮抗菌株，期望為開發(fā)具有應(yīng)用價值的生防菌劑以及生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)，促進綠色有機農(nóng)業(yè)的發(fā)展，也為后續(xù)高效的生防菌劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源?；颐共?Botrytiscinerea)病原菌與黑斑病(Alternariatenuissima)病原菌[23-26]由吉林農(nóng)業(yè)大學植物病理系高潔教授提供。

1.1.2 培養(yǎng)基。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基：K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，瓊脂15 g加蒸餾水定容至1 000 ml，其中每80 ml幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中加入20 ml濃度為1%膠體幾丁質(zhì)。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 ml，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，酵母浸膏7.5 g，加蒸餾水定容至1 000 ml。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品采集。采用五點取樣法，收集江西省東鄉(xiāng)地區(qū)(116°61′E，28°23′N)野生稻的根際土于無菌自封袋內(nèi)，放于室溫內(nèi)備用。

1.2.2 拮抗菌株的分離、純化。采用平板稀釋涂布法，稱取5 g土樣放于裝有45 ml無菌水的三角瓶中，120 rpm，震蕩20 min后靜置5 min，取上清進行10倍濃度梯度稀釋。分別取10-1、10-2及10-3濃度的稀釋液各80 μL，每個梯度涂布3個幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板，用無菌水代替稀釋液做空白對照。倒置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落的生長及透明圈產(chǎn)生情況。

在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上，挑選透明圈較大但形態(tài)、顏色等不同的菌落，進行平板劃線，直至菌落單一，編號，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 拮抗菌的篩選。采用平板對峙法，測定拮抗菌株對黑斑病和灰霉病的抑菌活性。先將灰霉病和黑斑病在PDA平板上進行活化，挑選長勢旺盛的灰霉病和黑斑病病原菌平板，用打孔器制成直徑為7 mm的菌餅，倒置于PDA平板，將拮抗菌菌餅接種在距病原菌約2 cm處，其中以不接拮抗菌的平板為對照，每組3個重復(fù)，置于26 ℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～6 d，觀察抑菌圈的大小。并在第2 d、4 d、6 d的時候記錄病原菌的菌落最小半徑以及對照菌落的半徑，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照菌落半徑-病原菌菌落半徑)/對照菌落半徑×100

將初篩得到抑制效果較好的菌株的菌餅接種于121 ℃下高壓滅菌過的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于26 ℃搖床，160 rpm恒溫震蕩48 h后，三層無菌紗布過濾，將不同菌株的濾液5 000 rpm離心5 min后收集菌體，無菌水洗滌2次后重懸浮無菌水中，血球計數(shù)板測定濃度并將其稀釋濃度為107cfu·mL-1，備用。

1.2.4 菌株發(fā)酵液和化學農(nóng)藥對灰霉病和黑斑病抑制效果比較。農(nóng)藥稀釋液制備：將市售灰霉病特效素(北美農(nóng)大)和50%苯醚甲環(huán)唑(北美農(nóng)大)按照使用說明分別對灰霉病特效素和苯醚甲環(huán)唑進行250倍稀釋和500倍稀釋。

拮抗試驗：分別取100 μl 拮抗菌的發(fā)酵濾液、250倍灰霉病特效素稀釋液、500倍灰霉稀釋液、250倍苯醚甲環(huán)唑稀釋液及500倍苯醚甲環(huán)唑稀釋液涂布于PDA平板，平皿中央分別接種7 mm活化后的灰霉病和黑斑病病原菌菌餅，以無菌水為對照，每組3個重復(fù)，26 ℃下恒溫培養(yǎng)，在第2 d、3 d、4 d、5 d測量病原菌的直徑，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-病原菌菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察與生理生化鑒定。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰系統(tǒng)鑒定手冊》中推薦的部分培養(yǎng)基和方法，對拮抗菌株進行形態(tài)學觀察及生理生化鑒定，其中主要包括硝酸鹽還原試驗、接觸酶反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、V-P測定、淀粉水解、明膠液化、硫化氫反應(yīng)、吲哚反應(yīng)及耐鹽性(2%、5%、7%和10%)。

1.3.2 16S rDNA序列擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析。利用CTAB方法提取菌株的基因組，進行16S rDNA的擴增。PCR通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，反應(yīng)體系25 μl，Premix version 2.0 12.5 μl，27 F (10 μM) 1 μl，1492 R(10 μM)1 μl，DNA模板1 μl，無菌水補足至25 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，所得序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫。通過Blast分析與基因庫中序列進行同源性比對，并用Mega 5.1軟件中Neihbor-Joinhing構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2003和Graphpad Prism 6結(jié)果統(tǒng)計和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果分析

2.1 拮抗菌的分離篩選

利用幾丁質(zhì)培養(yǎng)基，從江西省東鄉(xiāng)野生稻根際土壤中獲得64株產(chǎn)透明圈較大的可分解幾丁質(zhì)的菌株。通過平板對峙法測定了拮抗菌株與灰霉病、黑斑病的拮抗效果，其中有5株拮抗菌(A2、A6、A10、F7和G6)對灰霉病和黑斑病有穩(wěn)定的拮抗效果(圖1，圖2)。通過第2 d、4 d、6 d對灰霉病和黑斑病菌落半徑的測量，得出抑菌率。從表1可知，拮抗菌株對灰霉病與黑斑病均有抑制作用，雖效果不同，但整體隨著拮抗天數(shù)增加呈上升趨勢。其中菌株A2和G6對灰霉病表現(xiàn)出較強的抑制作用，在2～6 d，拮抗作用分別高于78.3%和77.5%。對于黑斑病，菌株A2、F7和G6相對優(yōu)勢更加明顯，對黑斑病的抑制率分別達78.7%、77.47%和79.9%。

表1 不同天數(shù)拮抗菌株對灰霉病和黑斑病的抑制率(%)Table 1 Inhibition rates of antagonistic strains on Botrytis cinerea and Alternaria tenuissima in different days

注：數(shù)據(jù)為均值±標準差；同列數(shù)據(jù)后面的不同字母表示在0.05水平上差異顯著(P<0.05)；灰霉病和黑斑病是分開比較的。

Note:The data in the table is mean value±SD;Different letters in the same column indicate significant differences at 0.05 level(P<0.05);BotrytiscinereaandAlternariatenuissimaare compared separately.

2.2 菌株發(fā)酵液和化學農(nóng)藥的抑菌效果

隨著天數(shù)的增加，拮抗菌的抑菌作用越來越強，而化學農(nóng)藥的抑菌效果則越來越弱。在第5 d時，拮抗菌株對灰霉病的抑制率能達到91.7%，而灰霉病特效素對灰霉病的抑制作用，隨著天數(shù)的增加而降低，第2 d的抑制效果最佳為68%(圖3)。從拮抗菌與苯醚甲環(huán)唑?qū)诎卟〉囊种谱饔媒Y(jié)果(圖4)可知，A2、F7和G6隨著天數(shù)增加，對黑斑抑制效果整體呈現(xiàn)上升趨勢，分別在第5 d時，抑制效果達83.3%、86.7%和85.7%。A6在第4 d抑制效果最佳達87.0%，而A10在第5 d的抑制效果最佳為60.9%。苯醚甲環(huán)唑隨著天數(shù)的增加抑菌效果逐漸降低，第2 d的抑制最好為47.3%。

2.3 拮抗菌生理生化特性及16S rDNA序列分析

生理生化試驗測定結(jié)果表明，菌株A2屬于接觸酶陰性，菌株A6、A10、F7和G6屬于接觸酶陽性，菌株A2、A6、A10、F7和G6對甲基紅反應(yīng)、V-P反應(yīng)以及吲哚反應(yīng)均為陰性，不產(chǎn)生硫化氫，明膠液化和淀粉水解均為陽性，對NaCl的耐受性較高，在10% NaCl含量下仍能生長(表2)。

表2 拮抗菌的部分生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic bacteria

注：“-”代表陰性，“+”代表陽性。

Note：“-” indicates negative，“+” indicates positive.

菌株A2、A6、A10、F7和G6經(jīng)DNA測序后分別得到1431 bp、1422 bp、1438 bp、1431 bp和1428 bp序列。將DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對后，經(jīng)Mega 5.1構(gòu)建系統(tǒng)進化樹如圖5所示，其中A2與Streptomycesmisionensis、Streptomycesbacterium、Streptomycessp.的聚類到一起；A6、A10、F7、G6分別與Micromonosporapurpureochromogenes、Paenibacillussp.、Streptomycesansochromogenes、Streptomycessp.和Streptomyceshygroscopicus聚類到一起。結(jié)合菌株的生理生化特征，將A2鑒定為Streptomycesmisionensis(米修鏈霉菌)；A6鑒定為Micromonosporapurpureochromogenes(絳紅產(chǎn)色小單孢菌)；A10鑒定為Paenibacillussp.(類芽孢桿菌)；F7鑒定為Streptomycesansochromogenes(圈卷產(chǎn)色鏈霉菌)；G6鑒定為Streptomycessp.(鏈霉菌)。

3 討 論

當前，植物病害防治措施已從單純依賴化學防治逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)境友好及經(jīng)濟效益較高的生物防治[27]。分離篩選具有良好的環(huán)境適應(yīng)性、廣譜抗菌和拮抗效果穩(wěn)定的生防菌，是生物防治成功的關(guān)鍵步驟[28]。由于幾丁質(zhì)是構(gòu)成病原真菌細胞壁的主要成分[29]，而真菌生長條件相對簡單且周期短[30]，因此通過破壞真菌細胞壁骨架，從而影響真菌形態(tài)建成、生長發(fā)育和致病力可作為對抗真菌病害的有效途徑之一[31]。本文通過從江西省東鄉(xiāng)野生稻根際土壤中分離篩選了64株可分解幾丁質(zhì)的菌株，在64株菌株中經(jīng)平板對峙試驗，反復(fù)篩選，獲得5株對灰霉病和黑斑病有穩(wěn)定拮抗作用的菌株即A2、A6、A10、F7和G6。其中菌株A2、G6對灰霉病的拮抗效果相對較好，拮抗作用在93.0%之上；A2、F7和G6對黑斑病的拮抗作用相對較好，拮抗作用在77.0%之上。另外，5株菌的發(fā)酵濾液與市售化學農(nóng)藥比較，均表現(xiàn)出較好的抑菌效果。且隨著作用天數(shù)的增加抑菌效果逐漸增強，如若將發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)有效分離提取，生物農(nóng)藥將有望替代化學農(nóng)藥，對于抑菌物質(zhì)的研究也是未來的研究熱門。

根據(jù)菌株的生理生化特征以及16S rDNA分子測序技術(shù)，鑒定這5株菌分別為：米修鏈霉菌(Streptomycesmisionensis)、絳紅產(chǎn)色小單孢菌(Micromonosporapurpureochromogenes)、圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesansochromogenes)、鏈霉菌(Streptomycessp.)和類芽孢桿菌(Panenibacillussp.)。以上菌株在生物防治以及醫(yī)藥領(lǐng)域方面的貢獻均有一定報道，如王真真等的研究證明了米修鏈霉菌對水稻稻瘟病具有良好防治作用[32]，鹿連明等的研究中驗證了米修鏈霉菌對柑橘青霉病菌和綠霉病菌的抑制作用[33]。小單胞菌是一類分布廣泛可產(chǎn)生多種抗生素的稀有放線菌[34]，其中絳紅產(chǎn)色小單胞菌是慶大霉素B的主要產(chǎn)生菌[35]，慶大霉素作為廣譜抗生素在我國醫(yī)藥行業(yè)中有著至關(guān)重要的作用，因此絳紅產(chǎn)色小單胞菌的開發(fā)和應(yīng)用潛力巨大；圈卷產(chǎn)色鏈霉菌是尼可霉素的產(chǎn)生菌[36]，尼可霉素是抗真菌農(nóng)用抗生素有效成分之一[14]，作為幾丁質(zhì)合成酶的抑制劑是新一代的抗真菌藥物[37]。鏈霉菌是最主要的抗生素產(chǎn)生菌[38]，其多種次級代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及醫(yī)藥、食品等行業(yè)廣泛應(yīng)用[39]。類芽孢桿菌對細菌土傳病害有較好的抑制效果，在真菌病害中，如番茄灰霉病、青枯病及煙草赤星病等均有良好的防治效果[40-41]，王波的研究中發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌XZ-2發(fā)酵液可以明顯抑制大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌的菌絲生長[42]。因此本研究篩選鑒定的5株菌期望為生防菌的開發(fā)利用提供一定的技術(shù)支撐。

4 結(jié) 論

(1)菌株A2、A6、A10、F7和G6對灰霉病與黑斑病均有不同程度的抑制作用；(2)菌株發(fā)酵液對大豆灰霉病、黑斑病的抑制率高于化學農(nóng)藥灰霉病特效素和50%的苯醚甲環(huán)唑；(3)5株菌分別為：米修鏈霉菌(Streptomycesmisionensis)、絳紅產(chǎn)色小單孢菌(Micromonosporapurpureochromogenes)、圈卷產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesansochromogenes)、鏈霉菌(Streptomycessp.)和類芽孢桿菌(Panenibacillussp.)。