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      正骨水高效液相色譜指紋圖譜*

      2020-04-11 02:13:12范衛(wèi)鋒胡琴段婷婷葉志文
      醫(yī)藥導報 2020年2期
      關鍵詞:徐長卿丹皮正骨

      范衛(wèi)鋒,胡琴,段婷婷,葉志文

      (1.廣西玉林制藥集團有限責任公司,玉林 537001;2.廣州康臣藥物研究有限公司,廣州 510530)

      正骨水由徐長卿、兩面針、降香、五味藤、薄荷腦、樟腦等26味中草藥組成,具有活血祛瘀、舒筋活絡、消腫止痛等藥理作用,用于跌打扭傷以及體育運動前后消除疲勞[1],也有文獻報道正骨水治療肩周炎、凍瘡有效[2-3]。目前,采用氣相色譜-質譜(GC-MS)分析正骨水的成分,鑒別出正骨水29 種成分[4],而對于正骨水的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究筆者未見報道。中藥指紋圖譜能較好地反映中藥及其制劑內在質量的均一性和穩(wěn)定性,目前被國內外廣泛接受和采納作為質量控制手段之一[5-6]。筆者采用 HPLC 法對正骨水進行指紋圖譜研究,為正骨水的質量控制提供更多的參考依據(jù)。

      1 儀器與試藥

      1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Synsv0000超純水器(Millipore公司);JP-060超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司);BT 25S電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,感量:0.01 mg]。

      1.2藥品與試藥 丹皮酚(批號:110708-200506),4-甲氧基水楊醛(批號:110790-201404),樟腦(批號:111749-200601)均購于中國食品藥品檢定研究院,水為純化水,其他試劑均為分析純。19批正骨水,批號分別為213281(S1),213286(S2),213290(S3),213291(S4),213294(S5),213305(S6),213309(S7),213321(S8),213322(S9),213324(S10),213326(S11),213327(S12),1701002(S13),1701003(S14),1701004(S15),1701005(S16),1701006(S17),1701008(S18),1701010(S19),由廣西玉林制藥集團有限責任公司提供。

      2 方法與結果

      2.1色譜條件 Agilent Extend-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)為流動相;梯度洗脫,0~15 min,5%→20%A;>15~45 min,20%→30%A;>45~75 min,30%→50%A;>75~90 min,50%→80%A;>90~110 min,80%→100%A,流速:1.0 mL·min-1,柱溫:30 ℃,檢測波長為280 nm。

      2.2溶液的制備

      2.2.1對照品溶液的制備 取丹皮酚、4-甲氧基水楊醛、樟腦對照品適量,精密稱定,加甲醇制成1.998,2.016,99.7 mg·L-1溶液,即得。

      2.2.2供試品溶液的制備 精密量取正骨水100 μL,置10 mL量瓶中,加乙醇定容,搖勻即得。

      2.3方法學考察

      2.3.1精密度實驗 取正骨水溶液(批號:213281),按 “2.2.2”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣,測定連續(xù)進樣6次,進樣量5 μL。以丹皮酚色譜峰為參照,計算22個共有峰相對保留時間和相對峰面積,RSD均小于3%,表明儀器精密度良好。

      2.3.2溶液穩(wěn)定性實驗 取正骨水溶液(批號:213281),按“2.2.2”項方法制備供試品溶液,分別于制備后0,2,4,8,12,24,48,72 h進樣,進樣5 μL,按“2.1”項下色譜條件測定。以徐長卿藥材主要成分丹皮酚色譜峰為參照,計算22個共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%,結果表明供試品溶液放置72 h 穩(wěn)定。

      2.3.3重復性實驗 取正骨水溶液(批號:213281),按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液,制備 6 份供試品溶液,分別進樣測定,進樣5 μL,按“2.1”項下色譜條件測定,以徐長卿藥材主要成分丹皮酚色譜峰為參照,計算22個共有峰相對保留時間和相對峰面積,結果RSD均小于3%,表明方法重復性良好。

      2.4指紋圖譜的建立與分析

      2.4.1指紋圖譜的建立 取19批正骨水,按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定,得到19批正骨水的 HPLC 指紋圖譜,標記為S1~S19。見圖1。

      A.空白溶劑;B.對照品;C.正骨水;11.4-甲氧基水楊醛; 14.丹皮酚; 18.樟腦。

      圖1 正骨水和對照品的HPLC圖

      A. blank solivent;B.control solution;C.Zhenggushui;11.4-methoxysalicylaldehyde;14.paeonol;18.camphor

      Fig.1 HPLC chromatogram ofZhenggushuiand control

      表1 19批正骨水的相對保留時間

      2.4.2參照峰的選擇 丹皮酚為徐長卿的主要成分,其分離度好、出峰時間適中、峰面積較大且穩(wěn)定、易于辨認,故選擇其作為本品 HPLC 指紋圖譜的參照峰。

      2.4.3共有峰的標定 以14號(S)丹皮酚色譜峰為參照,計算樣品的22 個共有峰的相對保留時間、相對峰面積值,共有指紋峰特征參數(shù)見表 1,2。

      表2 19 批正骨水的相對峰面積

      2.4.4指紋圖譜的相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”2012 版(國家藥典委員會)對 19 批正骨水進行相似度評價,指紋圖譜疊加見圖2,相似度評價結果見表3。S1~S19 相似度>0.90。

      圖2 19 批正骨水HPLC 指紋譜疊加

      Fig.2 Overlay HPLC fingerprint of 19 batches ofZhenggushui

      2.4.5各特征峰的藥材歸屬 按正骨水制備方法制備徐長卿、兩面針、降香、五味藤、香加皮、香樟、樟腦、21味藥材蒸餾液,按“2.2.2”項方法,制成供試品溶液,再按“2.1”項色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,并與正骨水樣品的指紋圖譜進行比對,從而確認樣品指紋圖譜中各特征峰的歸屬,結果見表4。

      2.4.6正骨水色譜數(shù)據(jù)的聚類分析 將各樣品所得指紋圖譜的 22 個共有峰峰面積相對于稱樣量量化,運用SPSS 20.0版軟件對所有正骨水樣品進行系統(tǒng)聚類分析。采用 Ward 法,采用平方Euclidean距離法,計算不同批號樣品間相似程度,聚類分析結果見圖3。19批正骨水樣品大致分為 4 類:Ⅰ類包括批號為S1,S3,S4,S5,S6的樣品,Ⅱ類包括批號為S7,S8,S9,S10,S11,S12的樣品,Ⅲ類包括批號為S14,S15,S16,S17的樣品,Ⅳ類包括批號為S13,S18,S19的樣品;但整體而言,這19批正骨水樣品均聚在同一類,產品相似度比較集中,質量差異性較小。聚類分析得到的樣品之間的相關程度,與采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”2012 版(國家藥典委員會)計算樣品間相似度的相關性比較,結果一致。

      3 討論

      采用DAD 檢測對正骨水供試品溶液在200~400 nm波長紫外吸收進行考察,重點考察210,254,280,310和365 nm共5個波長,結果表明在280 nm 波長下,色譜信息豐富,各成分均有較好地吸收,各色譜峰分布均勻,且峰形大小合適,基線較平穩(wěn),因而選擇了280 nm作為檢測波長。

      表3 19批正骨水相似度評價

      表4 指紋圖譜中各特征峰的歸屬

      Tab.4 Affiliation of characteristic peaks in fingerprints

      藥材峰號徐長卿14降香6,7,9,10,11,12,13,15, 16,17,19,20,21兩面針1,3,4,5,8五味藤19藥材峰號香加皮11香樟22樟腦1821味藥材蒸餾液2,11,22

      圖3 聚類分析樹狀圖

      正骨水中九龍川、木香、海風藤等21味藥材,置回流提取罐中,加入一定濃度乙醇,加熱回流提取7 h后,進行蒸餾得到蒸餾液,進行液相色譜研究,得到色譜信息較少,正骨水HPLC指紋圖譜得到主要色譜峰來自用于浸漬的具有祛瘀止痛功效的降香[7]、兩面針[8-9]、徐長卿、五味藤、蒸餾提取的香加皮和香樟藥材、加入的樟腦原料藥。

      運用指紋圖譜技術可全面評價中藥復方制劑內在質量,其具有整體性、直觀性,相對于以單一對照品而言,其提供的信息更全面,更有價值[10-11]。本實驗對19批正骨水進行HPLC指紋圖譜的研究,標定22個共有峰,并指認了3個成分峰,確認14號峰為丹皮酚(徐長卿中主要成分[12]),11號峰為4-甲氧基水楊醛(香加皮中主要成分),確認18號峰為樟腦(樟腦原料),19批正骨水的相似度均>0.9,并對共有峰進行歸屬,結果表明各樣品的指紋圖譜主要峰整體一致,該法可作為正骨水質量控制方法之一。

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