吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子治療肺腺癌有效性的動(dòng)物研究

姚林艷，李超杰，王子寅，單群剛，龐浩鵬，陸 健，貢 桔，王忠敏，劉芬菊

癌癥是世界范圍主要公共衛(wèi)生問題，根據(jù)2018年世界癌癥報(bào)告（GLOBOCAN） 的數(shù)據(jù)顯示，肺癌是最常見的惡性腫瘤，它占總癌癥病例的11.6%，也是癌癥死亡的主要原因，占癌癥總死亡人數(shù)的18.4%[1-2]。在肺癌中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%以上，且大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)展為不宜手術(shù)的Ⅲ、Ⅳ期[3]。因此，晚期NSCLC 的治療傾向于多學(xué)科，包括手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、免疫治療和分子靶向療法等。

放射性粒子可局部直接植入腫瘤組織，通過放射線照射，能夠提供更高腫瘤靶區(qū)劑量，殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療目的[4]。在惡性腫瘤治療方面，國內(nèi)外已有應(yīng)用125I 放射性粒子植入治療有效性的報(bào)道[5]。然而，在細(xì)胞被電離輻射損傷后，會(huì)阻礙細(xì)胞周期，使細(xì)胞有足夠的時(shí)間來修復(fù)受損的DNA；此外，它在受損細(xì)胞中誘導(dǎo)不能修復(fù)的細(xì)胞凋亡，從而降低基因組的不穩(wěn)定性并降低細(xì)胞突變的可能性。因此，在放射治療過程中，腫瘤細(xì)胞可以通過細(xì)胞周期阻滯的作用，降低對(duì)射線的敏感性，從而降低治療效果[6]。

表皮生長因子受體（EGFR） 是一種受體型酪氨酸激酶，與表皮生長因子（EGF）結(jié)合后形成同源或異源二聚體，從而激活細(xì)胞內(nèi)酶，啟動(dòng)細(xì)胞核中的相關(guān)基因，增高基因轉(zhuǎn)錄水平，破壞細(xì)胞生長平衡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，EGFR 在很多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)或異常表達(dá)，影響患者的預(yù)后[7-9]。EGFR 的表達(dá)與放療療效成負(fù)相關(guān)[10-11]。EGFR 是靶向治療的關(guān)鍵，在腫瘤基礎(chǔ)研究中，已證實(shí)EGFR 相關(guān)抗體及抑制劑可用于腫瘤治療[10，12]。吉非替尼是一種靶向EGFR 的小分子酪氨酸激酶抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制配體的結(jié)合位點(diǎn)，封閉其活性，從而達(dá)到阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制腫瘤生長的目的[9，13]。

大多數(shù)靶向治療主要是靶向惡性癌細(xì)胞，很大程度上忽略了腫瘤微環(huán)境的影響。NSCLC 中，患者對(duì)EGFR 抑制劑產(chǎn)生應(yīng)答，但是，由于腫瘤微環(huán)境的相互作用、旁路激活、靶點(diǎn)擴(kuò)增或再次突變等因素的影響，最終產(chǎn)生耐藥性[14]。放療和分子靶向治療是NSCLC 的重要治療手段。本研究將抗EGFR治療藥物吉非替尼和125I 放射性粒子聯(lián)合應(yīng)用，觀察吉非替尼和125I 放射性粒子是否具有協(xié)同抗腫瘤作用 。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

4～6 周齡的雌性BABL/c 裸鼠24 只，體重約20g（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供）。放射性粒子活度0.6mCi，生物半衰期為59.6 d 的125I 粒子（上海欣科醫(yī)藥有限公司提供）。吉非替尼（gefitinib）[商品名易瑞莎（Iressa）]由英國AstraZeneca提供，劑型：250 mg/片，溶解于5%葡萄糖溶液。穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的A549-luc 細(xì)胞（中國科學(xué)院提供）。熒光素酶底物（D-luciferin）（北京百靈威科技有限公司）；小動(dòng)物可見光活體成像系統(tǒng)IVIS Spectrum（Xenogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 人肺腺癌A549 細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立和分組 將人肺腺癌A549-luc 細(xì)胞1 x 107/mL 接種到裸鼠右側(cè)腋窩皮下，每只0.2 mL。隔天觀察移植瘤生長。每3～4 天用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤大小，接種20 d 后，當(dāng)移植瘤成瘤大小8～10 mm時(shí)，24 只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、125I 放射性粒子組，吉非替尼組，吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子組，每組6 只。吉非替尼單藥組：吉非替尼混懸液按0.1 mL/10g 規(guī)格灌胃，每天1 次，連續(xù)用藥5 周；125I 放射性粒子組：每個(gè)移植瘤內(nèi)置入1 枚0.6 mCi粒子源；聯(lián)合治療組：按125I 放射性粒子組及吉非替尼組的劑量聯(lián)合給予；對(duì)照組： 5%葡萄糖溶液，每天1 次灌胃，用量和用法與吉非替尼治療組相同。全部裸鼠均在末次給藥24 h后，通過頸椎脫位處死。根據(jù)公式V=L×W2/2（L 為最長徑，W2為與L 相垂直的橫徑）計(jì)算移植瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。剝離皮下腫瘤迅速將腫瘤組織切成多個(gè)小組織塊并置于液氮中以備RT-PCR 檢測(cè)使用。

1.2.2 活體生物熒光檢測(cè) 裸鼠皮下接種A549-luc細(xì)胞后，在接種后第3 周進(jìn)行活體熒光檢測(cè)，治療后第1、2、3 周應(yīng)用IVIS-Spectrum 系統(tǒng)檢測(cè)皮下移植瘤的生物發(fā)光信號(hào)。檢測(cè)時(shí)，每只裸鼠按照150 mg/kg體重的量腹腔內(nèi)注射熒光素底物，并在異氟烷麻醉后10～15 min 進(jìn)行體內(nèi)成像。成像后，應(yīng)用系統(tǒng)附帶軟件檢測(cè)皮下腫瘤生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.3 18 F-FDG Micro-PET/CT 成像 采用Super Nova PET/CT 掃描儀（PINGSENG Healthcare 公司），治療前和治療后1 周分別進(jìn)行顯像。將麻醉后的裸鼠俯臥位固定在掃描架上，先行CT 檢查（參數(shù)為80 kV，0.5 mA），曝光時(shí)間為10 min，然后以相同的體位進(jìn)行PET 采集。通過腹腔注射7.4 MBq18F-FDG 進(jìn)行PET 顯像，并在注射顯像劑后1 h 進(jìn)行延遲顯像，持續(xù)采集20 min。以3D 模式獲取圖像，重建冠狀、矢狀及橫斷面圖像。以腫瘤最大層面計(jì)算最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值（SUVmax）和平均標(biāo)準(zhǔn)攝取值（SUVmean ）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 移植瘤動(dòng)物模型

共計(jì)接種24 只，全部順利成瘤，成瘤率100%。從皮下種植開始至取瘤結(jié)束，所有裸鼠均全部存活，均未發(fā)現(xiàn)明顯放射誘導(dǎo)損傷。所有植入粒子未見移位、遺失，均成功回收，儲(chǔ)備在鉛盒中進(jìn)行安全處理。

2.2 抑瘤效應(yīng)

空白對(duì)照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子植入治療組，治療前的腫瘤體積分別為（282.89±71.32）mm3、（289.51±69.90）mm3、（287.79±32.96）mm3和（287.99±44.19）mm3，4 組中各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.015，P ＞0.05）；經(jīng)過4 種不同方法干預(yù)后2 周，各組移植瘤體積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.617，P ＜0.05），從此至治療結(jié)束3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即第3 至5 周，各組移植瘤體積間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.156，8.432，10.305，P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯(lián)合125I放射性粒子植入治療組治療后的腫瘤體積分別為（1 509.25±709.93） mm3、（840.45±43.35） mm3、（1 052.96±247.42） mm3和（317.34±52.08） mm3，吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子植入組低于其他3 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.305，P ＜0.05）。治療后，聯(lián)合組較125I 放射性粒子組和吉非替尼組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。如圖1 顯示了裸鼠接受不同方法干預(yù)后移植瘤生長曲線。

圖1 4 種不同方法處理下腫瘤體積變化

2.3 裸鼠體重

空白對(duì)照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼和吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子植入組治療前裸鼠體重分別為（26.17±1.72）、（26.17±1.33）、（24.83±2.40）和（26.67±1.86）g，差 異 無 統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（F=1.062，P＞0.05），治療后體重分別為（27.33±4.08）、（26.83±3.12）、（24.50±2.59）和（24.50±2.34）g，差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.408，P＞0.05），并均較治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。

2.4 生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)

圖2 125I 放射性粒子聯(lián)合吉非替尼組 腫瘤生物熒光強(qiáng)度明顯減弱

人肺腺癌A549-luc 細(xì)胞注射BALB/c 裸鼠3W 后，Xenogen IVIS-spectrum 小 動(dòng) 物 熒 光活體成像儀觀察裸鼠中腫瘤生長情況，腫瘤中熒光光子強(qiáng)度變化。結(jié)果顯示裸鼠種植部位可檢測(cè)到生物熒光，提示腫瘤發(fā)生。空白對(duì)照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子植入組治療前腫瘤部位生物發(fā)光光子數(shù)分別為（209371666.7±32194019.58）、（2 108 666666.7±76 166 519.33）、（188 318333.3±42 959 832.60）和（212 876 666.7±70 366 339.02） P/sec/cm2/sr，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.27，P ＞0.05），治療后檢測(cè)生物熒光信號(hào)，光子數(shù)分別為（198 605 000.0±12 976 503.00）、（99 263 333.33 ±49 293 480.57）、（87 419 500.0 ± 24 039 740.21）、（48 433 333.33±14 417 910.62）P/sec/cm2/sr，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.975，P ＜0.05），125I 放射性粒子植入組、吉非替尼和吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子植入組差異均較治療前有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=6.392、9.946、6.677，P ＜0.05），吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子植入組低于其他3 組?？瞻讓?duì)照組較治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=1.189，P ＞0.05）。腫瘤體積大小結(jié)果與生物熒光值強(qiáng)弱趨勢(shì)基本一致。見圖2、圖3、圖4、圖5（ ①為治療前，②、③、④治療后1 周、2 周、3 周）

2.5 18F-FDG Micro-PET 代謝監(jiān)測(cè)

空白對(duì)照組、125I 放射性粒子植入組、吉非替尼組和吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子植入組的18F-FDG SUVmax 治療前為0.85±0.12、0.85±0.12、0.79±0.05、0.82±0.09，治療后為0.88±0.13、0.77±0.10、0.75±0.19、0.75±0.03，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.449、1.604，P ＞0.05）。SUVmean 治療前為0.45±0.06、0.55±0.15、0.52±0.05、0.51±0.08，治 療 后為0.56±0.07、0.54±0.06、0.49±0.12、0.48±0.04，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.155、1.604，P ＞0.05）。如圖6 治療前和125I 放射性粒子聯(lián)合吉非替尼治療1 周后。

圖3 125I 放射性粒子組 腫瘤生物熒光強(qiáng)度沒有明顯減弱

圖4 吉非替尼組 腫瘤生物熒光強(qiáng)度沒有明顯減弱

圖5 對(duì)照組 腫瘤生物熒光強(qiáng)度增強(qiáng)

圖6 治療前和治療1 周后

3 討論

近年來，隨著微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展，放射性粒子植入在惡性腫瘤的治療中取得了較快進(jìn)展。125I 是一種合成的核素，半衰期為59.63 d,在衰減時(shí)釋放能量，分別為27.4 KeV、35.5 KeV 的X 射線、γ 射線；有效的殺傷半徑范圍是1.0～1.5 cm。目前臨床使用的125I 放射性粒子長徑為（4.50±0.3） mm，直徑為（0.80±0.03） mm；每粒粒子放射性活度在0.5～0.8 mCi[15]。125I 放射活性低、療效高、精確度高，對(duì)正常組織的損傷小等特點(diǎn)。通過將放射性粒子置于腫瘤內(nèi)，釋放出低能γ 射線破壞腫瘤細(xì)胞周期，且在殺滅腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用[16-17]。DNA 是輻射的主要目標(biāo)，放射可以使機(jī)體內(nèi)的水分子電離并產(chǎn)生自由基，自由基與生物大分子相互作用，造成組織細(xì)胞傷害。

EGFR 是原癌基因Cerb-1（HER-1）表達(dá)產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，與相應(yīng)配體結(jié)合后，引起特定的酪氨酸殘基自動(dòng)磷酸化，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和血管生成，其通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞生長[18]。EGFR 在很多惡性腫瘤中存在高表達(dá)或異常表達(dá)，尤其是在NSCLC 中，其陽性率甚至高達(dá)80%～85%，而這種高表達(dá)狀態(tài)是導(dǎo)致NSCLC 放療抵抗的重要因素[11]。吉非替尼是一種EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKI），它競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合于細(xì)胞表面Mg-ATP 結(jié)合位點(diǎn)上，阻斷其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使細(xì)胞周期停止在G0～G1 交界期，從而抑制細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[19-20]。本研究中，4 組裸鼠移植瘤治療后其體積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.305，P ＜0.05），且吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子組治療后腫瘤體積（317.34±52.08） mm3明顯小于其他組的（1 509.25±709.93）、（840.45±43.35）、（1 052.96±247.42） mm3。因此，125I 放射性粒子聯(lián)合吉非替尼能夠更有效抑制腫瘤生長，但是具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

近年來，分子成像技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物腫瘤模型無創(chuàng)、連續(xù)、實(shí)時(shí)地觀察，為腫瘤的分子診斷及治療提供了重要的研究方法[21]，其中生物發(fā)光成像可以檢測(cè)到動(dòng)物模型中微小病灶，靈敏度高、安全系數(shù)高、沒有放射性危害、操作簡單、定量準(zhǔn)確[22]。熒光素酶在ATP 和氧存在的情況下催化熒光素氧化，并在熒光素氧化的過程中，發(fā)出生物熒光。使用熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行小動(dòng)物體內(nèi)成像可以更有效地觀察腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并評(píng)估治療效果[23]。本研究中，在動(dòng)物熒光活體成像儀觀察裸鼠中腫瘤生長情況，治療后檢測(cè)生物熒光信號(hào)，光子數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，吉非替尼聯(lián)合125I 放射性粒子組低于其他3 組。

18F-FDG（氟脫氧葡萄糖）是最主要的腫瘤顯像劑之一，惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的需求量大，注射18F-FDG 后，腫瘤病灶部位呈高攝取狀態(tài)。因此，18F-FDG PET 顯像為功能顯像。本實(shí)驗(yàn)建立了A549-luc 裸鼠腫瘤模型，結(jié)果顯示，治療前與治療后腫瘤部分?jǐn)z取狀態(tài)并沒有明顯變化，SUVmax和SUVmean 前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)有以下可能：選擇的是人肺癌A549 細(xì)胞，制作裸鼠肺腺癌模型，可能存在異質(zhì)性差異，也可能存在裸鼠體質(zhì)差異，另外可能實(shí)驗(yàn)尚未探索出可以表達(dá)陽性結(jié)果的濃度及劑量。在相關(guān)文獻(xiàn)中，也并沒有發(fā)現(xiàn)應(yīng)用A549 細(xì)胞建成的裸鼠肺腺癌模型，在18F-FDG Micro-PET/CT 成像中相關(guān)陽性結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)中，通過皮下注射A549-luc 細(xì)胞建立裸鼠腋下移植瘤模型，采用125I 放射性粒子，吉非替尼，125I 放射性粒子聯(lián)合吉非替尼分別作用于裸鼠，測(cè)量腫瘤大小，利用生物發(fā)光成像技術(shù)檢測(cè)治療前后裸鼠移植瘤生物發(fā)光信號(hào)值，隨治療時(shí)間的延長，皮下移植瘤的體積增長受到抑制，生物發(fā)光信號(hào)逐漸降低，結(jié)果顯示各治療組均能抑制腫瘤組織生長，而125I 放射性粒子聯(lián)合吉非替尼組作用更顯著。兩藥在抑瘤方面具有一定的協(xié)同作用。本次實(shí)驗(yàn)各組樣本量較少，具有局限性，研究中對(duì)于125I 放射性粒子與吉非替尼聯(lián)合作用機(jī)制仍未明確，接下來需要加大樣本量研究并進(jìn)一步探討協(xié)同作用機(jī)制。