E.coli K-12琥珀酸脫氫酶sdhC基因納米錐的設(shè)計(jì)及自組裝

周末，劉彥君，佟欣瑞，董延甲，吳欣瑜，王迎香，應(yīng)明

（1天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，天津300384；2天津理工大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與工程學(xué)院，天津300384）

除小部分病毒外，所有生命的遺傳物質(zhì)都是雙鏈DNA。DNA 分子不僅具有特異性識(shí)別能力，而且遵守嚴(yán)格的自組裝機(jī)制，因此天然的DNA 分子是研制靶向藥物載體的優(yōu)選材料。近幾年悄然發(fā)展起來的DNA折紙術(shù)（DNA origami），就是一種采用計(jì)算機(jī)精準(zhǔn)設(shè)計(jì)進(jìn)行核酸納米材料自組裝的新方法[1-2]。2008 年丹麥Aarhus 大學(xué)的Andersen[3]開發(fā)了一款UNIX 系統(tǒng)適用的DNA 折紙軟件——SARSE，利用該軟件首先進(jìn)行了DNA 二維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，成功得到了約50nm×150nm 尾巴酷似在擺動(dòng)的海豚圖案；不久后該團(tuán)隊(duì)又設(shè)計(jì)出一個(gè)帶有可“開-關(guān)”蓋子的DNA 盒子，將該軟件用于了DNA 三維折疊設(shè)計(jì)[4]。DNA 折紙用到最多的開源軟件是Douglas設(shè)計(jì)的caDNAno，研究者可利用其中的蜂巢模型或方格模型進(jìn)行腳手架鏈和訂書釘鏈的設(shè)計(jì)，在二維界面構(gòu)建堆疊DNA 圖形[5]。麻省理工學(xué)院（MIT）Bathe 團(tuán)隊(duì)研發(fā)的CanDo 和DAEDALUS，是目前進(jìn)行DNA 三維立體設(shè)計(jì)功能最完善的軟件，CanDo是一款在線分析軟件，能依據(jù)caDNAno 的設(shè)計(jì)圖進(jìn)行DNA立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[6]；DAEDALUS 是由Matlab編寫的涵蓋多種立體構(gòu)象的源代碼，Bathe 團(tuán)隊(duì)依靠這種軟件，采用M13mp18 單鏈環(huán)形DNA 構(gòu)建出了立方體、正八面體、正二十面體等納米結(jié)構(gòu)DNA[7]，最近該團(tuán)隊(duì)還報(bào)道了使用caDNAno 構(gòu)建了結(jié)構(gòu)復(fù)雜的荷花型和貝殼形DNA納米材料[8]。2006年上海交通大學(xué)Bio-X 中心，同樣采用M13mp18單鏈核酸折疊出一幅中國地圖[9]。從前期研究可以看出，人們已經(jīng)能夠?qū)⒁粋€(gè)單鏈核酸折疊成各種盡可能復(fù)雜的圖形，M13mp18 單鏈環(huán)形DNA 是進(jìn)行這種單鏈折疊的主要材料。但如何將DNA 折紙術(shù)用于普通基因組核酸材料，如何將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際的研究領(lǐng)域中，都是該項(xiàng)技術(shù)是否能得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

本文作者項(xiàng)目組即以此為目的，采用生物實(shí)驗(yàn)室最常用的模式菌株E.coliK-12 MG1655，作為琥珀酸脫氫酶sdhC 基因的供體菌。sdhC 是中心代謝的一個(gè)基因，在生命體中普遍存在，其研究結(jié)果具有一定的代表性。首先利用改進(jìn)后的DAEDALUS軟件，設(shè)計(jì)出與sdhC 基因序列互補(bǔ)的16 條訂書釘鏈[10]。這16 條訂書釘鏈與PCR 擴(kuò)增得到的sdhC 雙鏈DNA 進(jìn)行鏈內(nèi)置換，最終組裝出了與預(yù)設(shè)模型基本一致的正四面錐。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，sdhC 基因的核酸鏈在自組裝前后，DNA 凝膠電泳條帶的位置發(fā)生了明顯變化。采用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)樣品為均勻分散的錐形顆粒，尺度約為15.02～23.97nm。采用原子力顯微鏡進(jìn)行該納米錐液下的三維立體結(jié)構(gòu)成像，可觀測(cè)到一個(gè)完整清晰的正四面錐體，說明大腸桿菌的普通基因序列，被成功組裝成了一個(gè)對(duì)稱的納米錐結(jié)構(gòu)。這種核酸納米錐具有很強(qiáng)的生物相容性，可以幫助尺度適宜的藥物進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞，提高藥物精準(zhǔn)釋放和靶向作用的能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 sdhC基因納米錐設(shè)計(jì)

首 先 改 進(jìn) DAEDALUS 軟 件 中 的DX_cage_design模塊，使該軟件能讀取sdhC基因的核酸序列。按照Waston-Crick 的B 型DNA 雙螺旋模型，每螺旋為10.5 個(gè)堿基對(duì)時(shí)，DNA 折疊的應(yīng)力最小，所以待設(shè)計(jì)的正四面錐的每條棱應(yīng)有n10.5bp（n為正整數(shù)）個(gè)堿基，且由兩條訂書釘單鏈和兩條腳手架鏈組成。在DAEDALUS源代碼中，加入一個(gè)求余函數(shù)rem（edge_length，21），檢測(cè)每條棱的堿基數(shù)是否為21bp 的整數(shù)倍，如果不是，程序則會(huì)自動(dòng)在棱上增加5、10 或11 個(gè)堿基。同理，DAEDALUS 輸出訂書釘鏈也會(huì)盡量接近n21bp，以保證核酸自組裝時(shí)不產(chǎn)生過度彎曲[11]。理論上DAEDALUS 允許輸入腳手架鏈的堿基個(gè)數(shù)沒有限制，但是源代碼中的參數(shù)均依照M13mp18單鏈DNA（7249bp）設(shè)定。為重新設(shè)定計(jì)算參數(shù)，對(duì)sdhC 基因序列進(jìn)行了上下游延伸處理，即在sdhC基因序列上下游各補(bǔ)充117bp，其基因圖譜如圖1 所示，總長為624bp，其中118～507bp 為sdhC基因。將該624bp 的堿基序列作為腳手架鏈輸入DAEDALUS軟件，腳手架鏈序列如表1所示。經(jīng)過計(jì)算正四面錐各棱含有兩組堿基數(shù)為52bp 的DNA雙鏈，圖1中的箭頭表示折疊后每條棱對(duì)應(yīng)的堿基位置，AD 棱的堿基序列包括（1，33）、（606，624）、（138，189）；CD棱包括（34，86）、（503，553）；BD 棱包括（87，137）、（242，294）；AB 棱包括（190，241）、（348，399）；BC 棱包括（295，347）、（452，502）；AC棱包括（400，451）、（554，605）。

表1 腳手架鏈堿基序列

圖1 sdhC基因納米錐腳手架鏈基因圖譜

圖2 sdhC基因納米錐設(shè)計(jì)圖（1?=0.1nm）

圖2為sdhC基因納米錐的設(shè)計(jì)過程，深色粗實(shí)線代表腳手架鏈，淺色粗實(shí)線代表訂書釘鏈。624bp 的腳手架鏈在16 條互補(bǔ)的訂書釘鏈作用下，不中斷地來回折疊，每條棱都是由兩條腳手架單鏈和兩條互補(bǔ)的訂書釘單鏈相互纏繞形成[12]。如圖2(c)所示，正四面錐6條棱的設(shè)計(jì)略有不同，根據(jù)腳手架鏈的形態(tài)可分為兩組：第一組AB、AC、AD為無隔斷棱；第二組BC、BD、CD 為有隔斷棱，腳手架鏈的3’端和5’端均在AD棱上。訂書釘鏈共有4 種類型，分別為回型（Clip）、鉤型（Hook）、夾型（Pin）以及凸型（Convex）。圖2(a)給出了與頂點(diǎn)B相連的3條棱的結(jié)構(gòu)，每條棱兩端皆是部分凸型鏈，BC 與BD 棱中部由兩個(gè)31bp 的鉤型釘書釘鏈形成，AB棱中部由一條長42bp回型訂書釘鏈和一條20bp 夾型訂書釘鏈形成。棱結(jié)構(gòu)AD、AC 與AB 相同，BD、CD 與BC 相同。頂點(diǎn)B由78bp凸型訂書釘鏈形成，如圖2(b)所示，且各頂角的訂書釘鏈形狀、長短皆相同。其中每個(gè)構(gòu)成頂角的凸型訂書釘鏈中加入了一段長5bp 的poly（T）結(jié)構(gòu)，與腳手架鏈不匹配，形成一個(gè)單鏈的折角。表2為在DAEDALUS輸出的16條訂書釘鏈的序列，帶下劃線的堿基表示poly（T）結(jié)構(gòu)。圖2(c)為DAEDALUS 設(shè)計(jì)出的最終納米錐的立體結(jié)構(gòu)，最終形成每條棱包含52bp 的正四面體，長度為17.68nm，按照B 型DNA 雙螺旋模型計(jì)算，每兩個(gè)堿基之間距離為0.34nm，所以每條棱長是52×0.34nm＝17.68nm，每條棱的兩條腳手架鏈長度相同，均為52bp，且上下各錯(cuò)開一個(gè)堿基，以形成拐點(diǎn)，如圖2(a)所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌（E.coliK-12 MG1655）甘油菌為本實(shí)驗(yàn)室保藏[13]；引物、訂書釘鏈、Taq DNA 聚合酶由TaKaRa 公司合成；DNA MarkerII 購自北京鼎國生物公司。實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：凝膠電泳儀（DYCP-31CN 型，北京六一生物科技有限公司）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（MERLIN Compact 型，德國ZEISS 公司）；原子力顯微鏡（ICON 型，德國Bruker公司）；透射電子顯微鏡（JEM-2100型，日本JEOL 電子株式會(huì)社）；PCR 儀（T-Gradient Thermoblock型，德國Biometra公司）

1.3 PCR法制備腳手架鏈

在Genebank中查詢的E.coliK-12 MG1655sdhC基因序列（Gene ID：945316，390bp），并在上下游各補(bǔ)充117bp，得到624bp 的堿基序列。依據(jù)該序 列 設(shè) 計(jì) 上 下 引 物 ： Primer-1 （5′-TGTCTGACCCGCAAGC-3′） ； Primer-2 （5′-CGCCACTGGTAGCGA-3′）。 提 取E. coliK-12 MG1655染色體，作為擴(kuò)增腳手架鏈的模板，進(jìn)行PCR 反 應(yīng)[3]。PCR 反 應(yīng) 體 系 為：10×PCR Buffer（Mg2+） 5μL； 4×dNTP Mixture 4μL； Primer-1（27.6μmol/L）1μL；Primer-2（28.2μmol/L）1μL；E.coliK-12 MG1655 染色體（150nmol/L）2μL；Ex Taq 酶0.25μL 及無菌水36.75μL 混勻，構(gòu)成50μL PCR 反應(yīng)體系。PCR 程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，從第二步循環(huán)30輪后，72℃保溫10min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[14]。

表2 訂書釘鏈堿基序列

1.4 自組裝sdhC基因納米錐

在200μL薄壁管中，將腳手架鏈和訂書釘鏈按照1∶10加入到自組裝緩沖溶液TAE/Mg2+中（2mol/L Tris，0.1mol/L CH3COOH，0.05mol/L 乙二胺四乙酸，12.5mmol/L Mg(CH3COO)2），混合成50μL 自組裝體系，放入可梯度控溫的PCR 儀中，組裝程序?yàn)椋?4℃變性4min，以0.6℃/s 的降溫速率降溫至20℃[15]，4℃保存10min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（AGE）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 sdhC基因納米錐自組裝策略

實(shí)驗(yàn)中采用雙鏈DNA 作為DNA 折紙的腳手架鏈，雙鏈DNA 是包括sdhC 基因在內(nèi)的624bp 雙鏈PCR 產(chǎn)物。因此與以往使用單鏈DNA 作為腳手架鏈的自組裝策略不同，本研究采用的是一種鏈置換組裝策略，如圖3(b)所示。當(dāng)加入的訂書釘鏈濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過雙鏈腳手架鏈時(shí)，在DNA 變性和復(fù)性過程中，訂書釘鏈取代了雙鏈DNA 中的一條鏈，發(fā)生鏈內(nèi)置換，將另一條鏈折疊為預(yù)設(shè)的核酸模型。實(shí)驗(yàn)的每一步均進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，圖3(a)為PCR 得到的雙鏈腳手架鏈電泳圖，大小為624bp，圖3(c)為組裝前后的電泳對(duì)比圖，泳道1為16 條訂書釘鏈，均為21～78nt 的短鏈核苷酸，泳道2為雙鏈腳手架鏈，泳道3為自組裝產(chǎn)物，很明顯組裝前后的電泳條帶存在一定差距，而且沒有檢測(cè)到訂書釘鏈，說明訂書釘鏈與腳手架鏈結(jié)合后，腳手架鏈發(fā)生了折疊，形成了與組裝前不同的空間結(jié)構(gòu)[16]。

圖3 sdhC基因納米錐組裝策略及凝膠電泳檢測(cè)

2.2 sdhC基因納米錐形貌分析

為了進(jìn)一步分析折疊后的DNA 空間構(gòu)象，將得到的自組裝產(chǎn)物超聲震蕩15～20min，取1μL 樣品涂布在云母片中央，沉積過夜，鍍金后使用SEM 進(jìn)行掃描檢測(cè)。圖4 是在工作電壓10kV，工作距離13.3mm，放大倍數(shù)10萬倍條件下的sdhC基因納米錐全貌圖。從圖中可以看出，自組裝產(chǎn)物為均勻分散、邊緣清晰且結(jié)構(gòu)完整的錐形納米顆粒，而在涂布了TAE/Mg2+的空白云母片上，未觀察到任何納米顆粒；左上角的插圖2 為一個(gè)錐體的放大圖，與插圖1中預(yù)設(shè)模型基本一致。通過對(duì)多次實(shí)驗(yàn)樣品的不同視野中幾百個(gè)顆粒的測(cè)定，得到的納米錐平均邊長為19.05nm，與最初設(shè)計(jì)僅相差1.37nm，這有可能是儀器檢測(cè)和手動(dòng)測(cè)量產(chǎn)生的誤差。圖5為SEM的能譜報(bào)告，滴加了樣品的云母片C、O的含量分別升高了9.3%、29.58%，樣品中還檢測(cè)出含0.19%的N 和1.64%的P，說明樣品為生物大分子。為了觀測(cè)自組裝產(chǎn)物在溶液中的形貌，本研究組采用TEM，取2μL 樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖6 所示，得到的三角錐邊長在（17.68±2）nm范圍內(nèi)，與SEM測(cè)定的尺度基本相符。

圖4 SEM掃描圖像

圖5 能譜分析

2.3 AFM分析

圖6 TEM掃描圖像

為了能更清晰地分析樣品在液體中的立體構(gòu)型，本研究使用AFM 進(jìn)行3D 分析。將新解離的1.3cm×1.8cm 云母片固定在2cm×2.5cm 的干凈玻璃片上，用透明膠將云母片表層清潔干凈，滴加3μL樣品于云母片中央，沉積3min。將BRUKER SNL-10 鍍金掃描探針，固定在液體探針夾上，并滴加30μL TAE/Mg2+緩沖溶液，進(jìn)行液下檢測(cè)。AFM 檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，樣品表面受探針壓力影響產(chǎn)生了一定的形變，但仍能觀察到清晰的錐體結(jié)構(gòu)，圖7(a)是其中一個(gè)納米錐的3D 圖像，其最高峰約為2.2nm，推測(cè)應(yīng)該是納米錐預(yù)設(shè)模型中的B 頂點(diǎn)，與B 頂點(diǎn)相連的3 條棱分別是CB、AB 和DB。圖7(b)為將探針與樣品間作用力轉(zhuǎn)化為樣品高度的曲線圖，即記錄了探針掃描過樣品每個(gè)點(diǎn)高度的數(shù)據(jù)，可以看出探針的走向是從一個(gè)低點(diǎn)升至一個(gè)最高點(diǎn)，再回到一個(gè)低點(diǎn)，3個(gè)方向趨勢(shì)相同，掃描過的距離即為3條棱CB、AB、DB的長度，分別為23.838nm、 15.245nm、 18.654nm， 平 均 為19.246nm；與預(yù)設(shè)模型的邊長相差1.566nm，基本符合預(yù)期設(shè)計(jì)。產(chǎn)生誤差的原因，有可能是原子力顯微鏡的探針對(duì)樣品產(chǎn)生的壓力，導(dǎo)致樣品形變，使測(cè)定邊長與實(shí)際邊長產(chǎn)生偏差。

3 結(jié)論

圖7 sdhC基因納米錐原子力顯微鏡3D成像圖

本研究采用E.coliK-12 MG1655琥珀酸脫氫酶C 亞基基因sdhC 核酸序列構(gòu)造出一種核酸納米錐體，是首次使用普通基因的雙鏈DNA 進(jìn)行DNA 折紙術(shù)設(shè)計(jì)。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳（AGE）、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）多種檢測(cè)手段驗(yàn)證，sdhC 基因的雙鏈DNA 確實(shí)被組裝成了與DAEDALUS 軟件預(yù)設(shè)模型基本一致的正四面錐，但尺度上存在微小差距，且不同表征方式檢測(cè)出的差距很接近。除了考慮是儀器檢測(cè)產(chǎn)生的測(cè)量誤差外，還有可能是組裝體系中的離子強(qiáng)度影響了B型DNA的螺旋方式，導(dǎo)致DNA 復(fù)性時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick 模型產(chǎn)生了偏差。所以在今后的研究中，還需要進(jìn)一步探索組裝體系和雙鏈DNA 長度對(duì)自組裝效率的影響，以及如何解決置換出的單鏈對(duì)自組裝過程干擾的問題?？傊?，本研究證實(shí)了雙鏈DNA 可以作為DNA折紙術(shù)的核酸材料，甚至可以按照藥物分子的需求“定制”相應(yīng)的DNA藥物載體。例如，sdhC基因納米錐可以載入邊長17nm 以內(nèi)的藥物分子，幫助藥物在細(xì)胞內(nèi)定點(diǎn)釋放出，尤其是在惡性腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)治療中發(fā)揮一定的作用。