煙酰胺乳膏劑的制備處方研究

洪靜，劉黎瑤,,通信作者，王慶奎

（天津農(nóng)學院 a.基礎科學學院，b.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

煙酰胺，化學名為吡啶3-甲酰胺[1]，參與機體內(nèi)多種氧化還原反應[2-4]，臨床上多用來治療代謝相關疾病，如唇炎、口角生瘡、肝臟疾病等[5-7]。研究表明，煙酰胺具有多種皮膚科藥理作用，能有效降低皮膚癌發(fā)病率，經(jīng)皮給藥之后具有抗自由基氧化、抑制黑色素轉(zhuǎn)移以及消炎等作用[8-10]，可用于開發(fā)抗衰老及局部治療的外用制劑。但是，由于煙酰胺具有酰胺的結(jié)構(gòu)，在空氣中長期放置會被氧化成煙酸，繼而對皮膚產(chǎn)生一定的刺激性[11]，因此，本研究中采用水中乳化的方式將煙酰胺制備成油包水型（W/O）乳膏劑，將煙酰胺包載于內(nèi)水相中以增加其穩(wěn)定性[12]，提高其經(jīng)皮給藥順應性。在研究過程中，通過單因素影響試驗，以離心穩(wěn)定性為評價指標，對油/水比例、乳化劑以及輔助乳化劑加入量（質(zhì)量分數(shù)）的范圍進行篩選，在保證乳膏劑具有較高離心穩(wěn)定性的前提下，通過正交篩選的方法，以外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性以及耐寒耐熱性的綜合評分作為考察指標，篩選出處方中油/水比例、乳化劑及輔助乳化劑最適加入量，確定制備乳膏劑的最優(yōu)工藝處方。根據(jù)該優(yōu)選處方，平行制備3批煙酰胺乳膏劑，初步研究25 ℃條件下煙酰胺乳膏劑的放置穩(wěn)定性，為其后期進一步應用奠定物質(zhì)基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（Sartorius，BSA 223S）；超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)儀器有限公司，KH5200B型）；紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；離心機（長沙湘儀儀器有限公司，H1650型）；電熱恒溫鼓風干燥箱（賽默飛世爾科技有限公司，DHG-9240A型）；醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司，HYC-360型）；恒溫水浴鍋等。

1.2 試藥

煙酰胺（江西兄弟醫(yī)藥有限公司，純度99%）；煙酰胺標準品（中國藥品生物制品檢定院，HPLC≥98%）；凡士林（天津奧淇洛譜商貿(mào)有限公司，分析純）；Span-60、Tween-80（天津市風船化學試劑有限公司，分析純）；其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 乳膏劑的制備方法

采用水中乳化法制備空白乳膏劑（基質(zhì)）以及載藥乳膏劑[13]。分別稱量處方量的蒸餾水與凡士林作為水相和油相，將其置于80 ℃的水浴條件下進行保溫。之后，將處方量的乳化劑以及輔助乳化劑分別加至油相中充分溶解。在磁力攪拌條件下將油相逐滴加至水相中并逐漸放冷，即得空白乳膏劑。

在制備載藥乳膏劑的過程中，取處方量的煙酰胺溶于水相中，后續(xù)制備過程與空白基質(zhì)相同。

2.2 煙酰胺含量測定方法

2.2.1 紫外光區(qū)全波長掃描

稱取煙酰胺標準品10 mg置于容量瓶中，加入蒸餾水超聲溶解并稀釋至適當質(zhì)量濃度之后，使用紫外-可見分光光度計測定其在200～400 nm波長區(qū)域內(nèi)的紫外吸收情況，并記錄該區(qū)域內(nèi)的掃描光譜圖。根據(jù)全波長掃描光譜圖選擇含量測定的最適波長。

2.2.2 標準曲線繪制

準確稱量煙酰胺標準品10 mg置于容量瓶中，加入蒸餾水超聲溶解并定容至100 mL，配制得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的儲備液。精密量取適量儲備液，并用蒸餾水稀釋得到5、10、15、20、25、30 μg/mL梯度質(zhì)量濃度的標準溶液。采用紫外分光光度法，在最適吸收波長條件下，測定上述系列標準溶液的吸光度。以標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并通過最小二乘法擬合出線性回歸方程。

2.2.3 精密度測定

取2.2.2部分的低、中、高質(zhì)量濃度的線性樣品連續(xù)測定5次，測定其在最適波長下的吸光度，記錄吸光度數(shù)值并計算相對標準偏差（RSD%）。

2.2.4 加樣回收試驗

精密稱取空白乳膏劑基質(zhì)10 g，向其中加入已知質(zhì)量濃度的煙酰胺標準溶液，使得其中煙酰胺的質(zhì)量濃度分別為 5、15、30 μg/mL，10 000 r/min離心10 min，將水層和油層完全分離，分取水層后測定其在最適波長下的吸光度，使用標準曲線的回歸方程計算水層中煙酰胺的質(zhì)量濃度及其加樣回收率。

2.3 單因素影響試驗

2.3.1 油相/水相質(zhì)量比例范圍的篩選

根據(jù)前期試驗結(jié)果，在保持乳化劑 Span-60以及輔助乳化劑 Tween-80的加入量均為 1% 的前提下，設定油相與水相的質(zhì)量比例分別為7/3、6/4、5/5、4/6、3/7，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）對油相/水相的質(zhì)量比例進行篩選。以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的油相/水相質(zhì)量比例范圍。

2.3.2 乳化劑Span-60用量范圍的篩選

在保持油相/水相的質(zhì)量比例為5/5以及輔助乳化劑Tween-80的加入量為1%的前提下，設定Span-60的加入量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）對 Span-60加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Span-60用量范圍。

2.3.3 輔助乳化劑Tween-80用量范圍的篩選

在保持油相/水相的質(zhì)量比例為5/5以及乳化劑 Span-60的加入量為 1% 的前提下，設定Tween-80的加入量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）對Tween-80加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Tween-80用量范圍。

2.4 正交設計試驗

根據(jù)單因素影響試驗結(jié)果，乳膏劑的穩(wěn)定性受油相/水相質(zhì)量比例（A）、乳化劑Span-60用量（B）以及輔助乳化劑 Tween-80用量（C）的影響。因此，進行三因素三水平的正交試驗，正交設計因素水平表如表1所示。

表1 正交設計因素水平表

本試驗以乳膏劑綜合評分[14-15]（根據(jù)外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒性以及耐熱性的綜合評價）為指標進行篩選，以得到制備乳膏劑的最佳處方工藝。其中，外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒及耐熱性的具體考察方法為：

（1）外觀均一性評價：取適量乳膏劑，目檢外觀是否均一，記錄結(jié)果并按照表2評分。

（2）涂布延展性評價：取適量乳膏劑，均勻涂布于濾紙上，觀察涂布過程是否細膩順滑，記錄結(jié)果并按照表2評分。

（3）離心穩(wěn)定性評價：取約0.5 g乳膏劑，置于離心管中，6 000 r/min離心20 min，觀察有無分層以及破乳現(xiàn)象，記錄結(jié)果并按照表2進行評分。

（4）耐寒性評價：取約2 g乳膏劑，于-20 ℃條件下保存24 h，觀察是否出現(xiàn)破乳分層，記錄結(jié)果并按照表2進行評分。

（5）耐熱性評價：取約2 g乳膏劑，于60 ℃條件下保存24 h，觀察是否出現(xiàn)破乳分層，記錄結(jié)果并按照表2進行評分。

W4#=0.6(0.6415,0.1279,0.7428,0.1056,0.0961)+0.4(0.2509,0.2159,0,0,0)T=(0.4853,0.1631,0.4457,0.0634,0.0577)T

表2 處方篩選各項考察指標評分表

2.5 優(yōu)選處方下煙酰胺乳膏劑的放置穩(wěn)定性考察

在優(yōu)選處方工藝下，制備3批煙酰胺乳膏劑，于25 ℃條件下密封放置0、1、2、3個月，分別對其煙酰胺含量、外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒及耐熱性進行評價，并對該優(yōu)選處方下放置穩(wěn)定性進行評價。

3 結(jié)果與分析

3.1 煙酰胺含量的測定方法

3.1.1 紫外全波長掃描

按照既定試驗方法，使用紫外分光光度計測定煙酰胺溶液在200～400 nm波長區(qū)域內(nèi)的紫外吸收情況，并繪制該區(qū)域內(nèi)的掃描光譜圖，如圖1所示。根據(jù)紫外全波長掃描光譜圖可知，測定煙酰胺含量的最適波長為260 nm。

圖1 煙酰胺溶液的紫外全波長掃描光譜圖

3.1.2 標準曲線繪制

按照既定的試驗方法，配制不同質(zhì)量濃度的煙酰胺標準品系列溶液，依法用紫外分光光度法進行檢測，并繪制標準曲線。如圖2所示。

圖2 煙酰胺標準品系列溶液標準曲線

由圖2可知，以吸光度（縱坐標，y）對濃度c（μg/mL，橫坐標，x）進行線性回歸，擬合得出的回歸方程為y＝ 0.026 1x＋ 0.007 3（R2＝0.999 45），煙酰胺標準品系列溶液在0～30 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

3.1.3 精密度測定

按照既定的試驗方法，低、中、高質(zhì)量濃度的煙酰胺標準品溶液的精密度測定結(jié)果如表 3所示。

表3 精密度試驗結(jié)果

測定結(jié)果表明，對低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液分別連續(xù)重復 5次測定的RSD值均小于2%，表明該測定方法的精密度良好。

3.1.4 加樣回收率試驗

依法對煙酰胺對照品進行回收率測定，測定結(jié)果如表4所示。試驗結(jié)果表明，在既定的測定方法下，低、中、高質(zhì)量濃度樣品的回收率均大于95%，并且平均回收率的RSD值均小于2%，表明該測定方法下煙酰胺對照品的回收率合格。

表4 加樣回收率測定結(jié)果

3.2 單因素影響試驗

3.2.1 油相/水相質(zhì)量比例范圍的篩選

按既定試驗方法，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）為評價指標，在保持乳化劑Span-60以及輔助乳化劑 Tween-80的加入量均為 1% 的前提下，對油相/水相的質(zhì)量比例范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的油相/水相質(zhì)量比例范圍。結(jié)果表明，當油相/水相的質(zhì)量比例為7/3、6/4、5/5時，乳膏劑的離心穩(wěn)定性良好，如表 5所示。

表5 油相/水相質(zhì)量比例篩選表

3.2.2 乳化劑Span-60用量范圍的篩選

根據(jù)既定試驗方法，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）為評價指標，在保持油相/水相質(zhì)量比例為5/5以及輔助乳化劑Tween-80的加入量為1%的前提下，對Span-60加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Span-60用量范圍。結(jié)果表明，當Span-60加入量為1%～2%時，乳膏劑的離心穩(wěn)定性良好。如表6所示。

表6 乳化劑Span-60用量范圍篩選表

3.2.3 輔助乳化劑Tween-80用量范圍的篩選

按既定試驗方法，以離心穩(wěn)定性（6 000 r/min×20 min）為評價指標，在保持油相/水相質(zhì)量比例為5/5以及乳化劑Span-60的加入量為1% 的前提下，對Tween-80加入量的范圍進行篩選，以篩選出能夠形成穩(wěn)定乳膏劑的Tween-80用量范圍。

結(jié)果表明，當Tween-80加入量為0～1%時，乳膏劑的離心穩(wěn)定性良好。如表7所示。

表7 輔助乳化劑Tween-80用量范圍篩選表

3.3 正交設計試驗

通過三因素三水平（L9，34）正交設計，以乳膏劑外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒耐熱性的綜合評分作為評價指標，對油相/水相質(zhì)量比例（A）、乳化劑Span-60用量（B）、輔助乳化劑Tween-80用量（C）進行正交篩選，篩選出制備煙酰胺乳膏劑的最佳處方，正交分析結(jié)果如表8所示。

結(jié)果表明，在影響該乳膏劑成型性的三大因素中，乳化劑Span-60用量對乳膏劑成型性的影響最大，其次是輔助乳化劑Tween-80用量和油相/水相質(zhì)量比例。通過正交極差分析得出最優(yōu)處方為 A2B1C2，即油相/水相質(zhì)量比例為 6/4、乳化劑Span-60用量為1%（m/m）、輔助乳化劑Tween-80用量為0.5%（m/m）。在該優(yōu)選處方下，乳膏劑成型性（外觀均一性、涂布延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒性耐熱性的綜合評分）最優(yōu)。

表8 乳膏劑處方篩選的正交試驗結(jié)果

3.4 優(yōu)選處方下煙酰胺乳膏劑的穩(wěn)定性評價

按最優(yōu)處方條件制備了3批煙酰胺乳膏劑，并對其放置穩(wěn)定性進行了初步性評價表征，結(jié)果如表9所示。

表9 煙酰胺乳膏劑的放置穩(wěn)定性評價（4 ℃）

結(jié)果表明，優(yōu)選處方下，所制備的3批煙酰胺乳膏劑載藥量為（3.3±0.51）%，外觀呈均勻的乳白色膏體，涂抹延展時細膩無顆粒感，離心穩(wěn)定性、耐寒及耐熱性均良好。將上述3批載藥乳膏劑置于25 ℃條件下進行放置穩(wěn)定性評價，結(jié)果表明，放置3個月內(nèi)的煙酰胺乳膏劑穩(wěn)定性良好，藥物含量、外觀均一性、涂布延展性、耐寒耐熱性以及離心穩(wěn)定性均未發(fā)生顯著變化。

4 討論

4.1 煙酰胺乳膏劑類型的選擇

根據(jù)油水比例及所使用乳化劑的性質(zhì)和用量的不同，乳膏劑可分為水包油（O/W）型和油包水（W/O）型，經(jīng)查閱大量文獻，本研究擬制備煙酰胺油包水（W/O）型乳膏劑。原因主要為以下兩點：

（1）增加主藥煙酰胺的化學穩(wěn)定性。研究表明，煙酰胺中的酰胺鍵在水溶液中不夠穩(wěn)定，容易受pH和氧氣的影響而生成煙酸，不僅會導致有效成分煙酰胺的藥理活性降低，同時所生成的煙酸具有一定的刺激性，對于某些敏感人群造成過敏反應。而在油包水（W/O）型軟膏劑中，通過復合乳化劑的作用，形成油相包覆水相的乳化結(jié)構(gòu)，外層油相能夠?qū)?nèi)層水相與空氣隔離開，從而避免內(nèi)層有效成分煙酰胺在貯存過程中發(fā)生氧化反應。因此本研究將煙酰胺乳膏劑制成油包水（W/O）型，使之更好地發(fā)揮多種藥理作用的同時降低其可能產(chǎn)生的不良反應。

（2）油脂保護作用。在實際應用中，外用油包水（W/O）型軟膏劑相較于水包油（O/W）型乳膏劑不易揮發(fā)、失水，因此作用時間更持久，且能夠在皮膚表層覆蓋一層油脂膜，增強皮膚的水合作用，易于有效成分經(jīng)皮遞送。因此，將煙酰胺制成油包水（W/O）型外用乳膏劑更利于其發(fā)揮藥理作用。

4.2 輔助乳化劑的作用

本研究中選擇Span-60作為乳化劑，但由于其親水親油平衡值較低，可能會造成乳膏劑分層、不穩(wěn)定等不良后果，因此，在乳膏劑制備過程中多采取加入輔助乳化劑的形式，通過乳化劑復配來調(diào)節(jié)Span-60的親水親油平衡值至適宜的范圍，有利于形成更穩(wěn)定的乳膏劑。

本研究中通過系統(tǒng)的處方篩選制備了煙酰胺乳膏劑，采用油包水型乳膏劑的形式，增加了煙酰胺的穩(wěn)定性，并有利于其經(jīng)皮遞送，具有很大的發(fā)展空間以及實際應用價值。在后期研究中，會考慮向其中加入其他抗氧劑，以進一步增加煙酰胺的貯存穩(wěn)定性。