正交試驗(yàn)優(yōu)化黑果枸杞果實(shí)中花青素的提取工藝

賀 盼，孔東升，2，3*，王 立，劉睿明

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省黑果枸杞工程研究中心河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生耐鹽、抗旱的灌木植物，黑果枸杞漿果呈球形，成熟后為紫黑色、無(wú)毒、有甜味，是一種有待開(kāi)發(fā)的野生植物資源[1]。黑果枸杞主要分布于我國(guó)寧夏、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆、西藏及陜西北部黃土高原[2]，而在甘肅則主要分布于河西走廊地區(qū)[3]。黑果枸杞果實(shí)具有強(qiáng)腎、潤(rùn)肺、明目、健胃、補(bǔ)腦、抗衰老及通經(jīng)作用[4]，是一種藥食同源的保健食品[5]，果實(shí)中含有豐富的人體必需酚類物質(zhì)、維生素、蛋白質(zhì)以及氨基酸，還含有豐富的常量及微量元素[6]，尤其是含有豐富花色苷，被稱為“花青素之王”?；ㄇ嗨赜址Q“花色素”，是一種水溶性的天然植物色素，安全無(wú)毒，屬于黃酮類化合物[7-8]，存在于植物的花、根、葉、果及種皮等部位的細(xì)胞液泡中[9]，具有抗發(fā)炎、降血糖、護(hù)肝等諸多藥理作用[10-13]，有較強(qiáng)的抗氧化、抗自由基以及抗衰老等功能[14-15]。近年來(lái)隨著人們對(duì)食品安全和自身健康的日益重視，紅花(Carthamustinctorius)紅色素、蘿卜(Raphanussativus)紅等多種天然色素已被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)用于飲料、乳制品和糕點(diǎn)中，花青素作為一種多功能天然色素，它的提取和應(yīng)用也受到越來(lái)越多的關(guān)注[16]。

目前，提取花青素的方法有水溶液提取法[17]、有機(jī)溶劑提取法[18]、超聲波輔助提取法[19]、微波輔助提取法[20]及微生物發(fā)酵提取法[21]等。其中，水溶劑提取法最簡(jiǎn)單易行，但對(duì)花青素的提取效率極低，而超聲波輔助、微波輔助及微生物輔助法等方法多需要特定設(shè)備且成本偏高。有機(jī)溶劑提取法已被證實(shí)適用于黑果枸杞色素提取，且具有簡(jiǎn)單、高效、無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)。李進(jìn)等[22]對(duì)新疆黑果枸杞色素提取的研究中確定pH 3.0的80%乙醇作浸提劑、提取溫度50℃、提取時(shí)間3 h、固液配比1:40為最佳提取條件；劉翔等[23]也利用有機(jī)溶劑提取法對(duì)新疆黑果枸杞花青素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明70%的1%酸性乙醇、固液比為1:20、置于暗處常溫浸提4 d為最佳條件；然而，在劉振華[24]對(duì)青海黑果枸杞花青素含量的研究中則認(rèn)為用70%濃度的乙醇、物料比為1:13、提取溫度為55℃、提取2.5 h為最佳條件。不同來(lái)源的黑果枸杞的花青素含量各異，提取參數(shù)的不同，提取率結(jié)果也不一樣[22-24]。河西走廊具有特殊的氣候，而且人工栽培的黑果枸杞有成熟期集中、水肥條件好、管理精細(xì)等特點(diǎn)，所需要提取的參數(shù)可能不同。尤其是花青素是一種具有較強(qiáng)極性的水溶性天然色素，當(dāng)試驗(yàn)中花青素含量與乙醇濃度二者的極性達(dá)到一致時(shí)花青素的溶出將達(dá)到最大值，就會(huì)導(dǎo)致物料比、溫度、時(shí)間參數(shù)的相應(yīng)變化，因此，許多學(xué)者[23]測(cè)定了不同種源的野生黑果枸杞花青素，可能導(dǎo)致不同種源花青素的提取用同一種參數(shù)時(shí)，提取率不一定都達(dá)到極值而無(wú)法比較，更沒(méi)有對(duì)特定的同一地區(qū)人工栽培條件下的花青素提取參數(shù)進(jìn)行研究。因此，本試驗(yàn)對(duì)玉門(mén)市人工栽培黑果枸杞果實(shí)采用有機(jī)溶劑提取的方法，并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化確定最佳提取條件，并確定是否需要脫脂，為后期河西走廊地區(qū)黑果枸杞優(yōu)良品種的選育和深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞果實(shí)：于2018年8月初采自甘肅省玉門(mén)市花海鎮(zhèn)、小金灣鄉(xiāng)、獨(dú)山子鄉(xiāng)人工栽培的黑果枸杞。

試劑：香草醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)、矢車菊-3-O-葡萄糖苷(四川省維克奇生物科技有限公司)、無(wú)水乙醇、石油醚(30～60℃)、鹽酸、硫酸均為分析純、甲醇為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平、粉碎機(jī)、60目篩、鼓風(fēng)干燥箱、恒溫水浴鍋(型號(hào)DK-98-Ⅱ天津市泰斯特儀器有限公司)、索氏提取器、離心機(jī)(型號(hào)3H12RI 湖南赫西儀器裝備有限公司)、pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(型號(hào)UV-1701PC)。

1.3 方法

1.3.1 材料的預(yù)處理

對(duì)黑果枸杞果實(shí)進(jìn)行干燥處理，并剔除破碎果實(shí)與果梗后粉碎，過(guò)60目篩。

1.3.2 花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

精密稱取10 mg矢車菊-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品配成1 mg/mL的溶液，分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL用硫酸香草醛法進(jìn)行吸光度測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=0.1545x+0.0135，R2=0.9828，其濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 花青素含量測(cè)定方法

將提取的花青素液置于分光光度計(jì)中，在黑果枸杞色素乙醇溶液最大吸收波長(zhǎng)(545 nm)條件下[27]測(cè)定吸光度三次，并取平均值。根據(jù)比爾定律可知，吸光度與色素濃度成正比，可直接用吸光度表示色素濃度或含量大小[26]。采用硫酸-香草醛法[27]測(cè)定花青素含量，其計(jì)算公式為﹕

式中，Ax為供試品溶液吸光度，Cr為對(duì)照品溶液濃度，Ar為對(duì)照品溶液吸光度，D為稀釋倍數(shù)，W為供試品質(zhì)量。

1.3.4 花青素提取的單因素試驗(yàn)

分別對(duì)pH值3.0的鹽酸-乙醇濃度、物料比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，提取劑pH值3.0的鹽酸-乙醇的濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%；物料比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50；提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h；提取溫度分別為 30、40、50、60、70、80℃，然后在轉(zhuǎn)速8000 r/min離心10 min提取上清液，加入2.5 mL 30%的硫酸溶液搖勻，再加入25 mL 1%的香草醛溶液，避光作用30 min，在分光光度計(jì)中測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花青素含量。各試驗(yàn)設(shè)置三重復(fù)。

1.3.5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

以提取溶劑濃度(A)物料比(B)提取時(shí)間(C)提取溫度(D)四個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1、表2)，以花青素提取率為指標(biāo)，優(yōu)化提取花青素的最佳參數(shù)。

表1 試驗(yàn)因素與水平

1.3.6 脫脂處理

準(zhǔn)確稱10 g黑果枸杞果實(shí)粉末與石油醚按照1∶10(g∶ml)混合置于索氏提取器中，于50℃水浴中回流提取3 h后，取出黑果枸杞粉末置于通風(fēng)陰涼處待其干燥后用于花青素提取。提取條件為pH值3.0的80%的鹽酸-乙醇、物料比為1∶15、提取時(shí)間為5 h、提取溫度為40℃進(jìn)行花青素的提取，重復(fù)三次試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取劑濃度對(duì)黑果枸杞花青素提取率的影響

花青素是一種具有較強(qiáng)極性的水溶性天然色素，在親水性有機(jī)溶劑中乙醇的極性最大，隨著乙醇濃度增大其極性也增大，當(dāng)兩者的極性達(dá)到一致時(shí)花青素的溶出將達(dá)到最大值，而后乙醇濃度的增大使得其極性偏離了花青素的極性[28]。如圖1所示，隨著乙醇濃度從20%上升到70%時(shí)，花青素的提取率也逐漸升高，并且在乙醇濃度達(dá)到70 %時(shí)，花青素提取率也達(dá)到了最大；而乙醇濃度從70%上升到100%時(shí)花青素的提取率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此，選擇濃度為pH值3.0的70%的鹽酸-乙醇為花青素提取的溶劑濃度。

2.1.2 物料比對(duì)黑果枸杞花青素提取率的影響

隨著加入提取劑體積的增大，其與枸杞果實(shí)粉末的接觸面積也在增大，更有利于花青素的溶出。但當(dāng)達(dá)到反應(yīng)飽和狀態(tài)后，提取劑的增加反而會(huì)溶出一些雜質(zhì)而影響花青素的提取率。如圖2所示，物料比在1∶15時(shí)花青素的提取達(dá)到了最高點(diǎn)，在1∶20之后處于下降趨勢(shì)，因此選擇1∶15為花青素提取的最佳物料比。

圖1 乙醇濃度對(duì)花青素提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of anthocyanin

圖2 物料比對(duì)花青素提取率的影響Fig. 2 Effect of material ratio on the extraction rate of anthocyanin

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑果枸杞花青素提取率的影響

花青素是一種不穩(wěn)定的物質(zhì)，易受到光照、氧氣等影響，所以提取花青素的時(shí)間是一個(gè)相當(dāng)重要的因素。如圖3所示，隨著時(shí)間從1 h上升至6 h，花青素的提取量也在上升并在6 h達(dá)到最高點(diǎn)，6 h之后花青素的提取量逐漸下降并趨于平穩(wěn)，因此，選擇6 h為適宜提取時(shí)間。

2.1.4 提取溫度對(duì)黑果枸杞花青素提取率的影響

花青素對(duì)高溫非常敏感，研究發(fā)現(xiàn)溫度越高花青素降解的速度越快[30]。如圖4所示，溫度從30℃上升至50℃，花青素的提取率也在上升，并在50℃達(dá)到最高點(diǎn)，提取率為0.868%，在60℃到80℃隨著溫度上升花青素的提取率逐漸下降，因此選擇50℃為花青素的適宜提取溫度。

圖3 提取時(shí)間對(duì)花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of anthocyanin

圖4 提取溫度對(duì)花青素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of anthocyanin

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)正交試驗(yàn)表2可以直觀的看出提取溶液濃度、時(shí)間、溫度及物料比四個(gè)影響因子中，提取時(shí)間(C)>提取溫度(D)>溶液濃度(A)>物料比(B)。所以，可以確定最優(yōu)組合為A3B2C1D1即80%的pH值3.0的鹽酸-乙醇、物料比為1∶15、提取時(shí)間為5 h、提取溫度為40℃。

2.3 脫脂對(duì)花青素提取率的影響

表3 黑果枸杞花青素提取結(jié)果

如表3所示，脫脂處理會(huì)明顯降低黑果枸杞花青素的提取率，比未脫脂果枸杞花青素提取率低了0.248%。這可能是石油醚脫脂的過(guò)程中脫掉了部分以單體形式存在的色素，從而導(dǎo)致其含量降低，也可能脫脂處理使黑果枸杞在空氣中暴露時(shí)間延長(zhǎng)，使得花青素被氧化。

3 討論

3.1 試驗(yàn)參數(shù)的確定

正交試驗(yàn)得到的參數(shù)與單因素試驗(yàn)結(jié)果有差異，表明多個(gè)因素相互作用影響了黑果枸杞花青素的提取率。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示,提取時(shí)間及提取溫度對(duì)其提取率影響最大，其次才是溶液濃度和物料比。正交試驗(yàn)最優(yōu)提取物料比與單因素保持一致，但相對(duì)于單因素試驗(yàn)結(jié)果而言，其提取時(shí)間相應(yīng)縮短了，而提取液濃度增大了，這是由于花青素的雙苯環(huán)結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的的極性，適當(dāng)?shù)脑黾犹崛∫簼舛仁箖烧邩O性達(dá)到一致，能夠促使花青素更快的溶出；高溫會(huì)加快花青素苷的降解，因此適當(dāng)?shù)慕档蜏囟葧?huì)減緩花青素的降解從而提高提取率[29]。但進(jìn)一步降低pH值是否會(huì)提高花青素提取率，還需要進(jìn)一步研究。

3.1 試驗(yàn)結(jié)果討論

本試驗(yàn)利用有機(jī)溶劑提取法，經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的優(yōu)化，最終測(cè)得黑果枸杞花青素含量均值為0.978%，脫脂后的花青素含量均值為0.730%，未脫脂的黑果枸杞果實(shí)花青素提取率明顯高于脫脂。雖然花青素提取方法的研究較多，但針對(duì)黑果枸杞的研究甚少尤其是河西走廊黑果枸杞，相同提取方法中，劉振華[27]測(cè)得市售和果枸杞花青素含量為0.424%；汪洋[29]測(cè)得青海、新疆、內(nèi)蒙、北京等地的黑果枸杞未脫脂花青素含量范圍為0.069%～0.84%，但不同提取參數(shù)，本試驗(yàn)所測(cè)結(jié)果稍優(yōu)于其他地區(qū)，可能是由于本試驗(yàn)所測(cè)黑果枸杞為人工栽培，其施肥、澆水等因素，使黑果枸杞果實(shí)優(yōu)于野生，導(dǎo)致本試驗(yàn)所測(cè)花青素高的原因；也可能是河西走廊地區(qū)特殊地理環(huán)境更適宜黑果枸杞積累更多的花青素。祁銀燕[24]等利用超聲輔助提取法測(cè)得柴達(dá)木野生和人工栽植黑果枸杞花青素含量分別為0.837%和0.897%，雖然超聲輔助提取比有機(jī)溶劑提取節(jié)省時(shí)間，但結(jié)果不相上下，并且有機(jī)溶劑提取更適用于后期大量黑果枸杞優(yōu)樹(shù)選擇的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定工作，而超聲輔助更適用于產(chǎn)業(yè)化花青素提取。

4 結(jié)論

鹽酸-乙醇溶液提取黑果枸杞果實(shí)花青素的最優(yōu)參數(shù)為pH值3.0的80%的鹽酸-乙醇、物料比為1∶15、提取時(shí)間為5 h、提取溫度為40℃，并且未脫脂的黑果枸杞最佳。本試驗(yàn)為后期黑果枸杞的優(yōu)良選育提供技術(shù)支持，從而帶動(dòng)甘肅河西走廊地區(qū)一系列以黑果枸杞為主的產(chǎn)業(yè)發(fā)揮較好的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)及社會(huì)效益。