丙泊酚對(duì)高糖誘導(dǎo)大鼠原代成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響研究

馮大鵬，石 磊，祝勇剛，呂昌偉，蔣 鵬

高血糖可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)組織、細(xì)胞病變及功能障礙，如心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松等[1-2]。當(dāng)前，糖尿病所引起的骨質(zhì)疏松、骨壞死等骨骼系統(tǒng)疾病的發(fā)病率日益增高，其后果不容忽視。這些疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)為高血糖條件下的細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，這個(gè)過(guò)程中大量生成的活性氧(ROS)直接導(dǎo)致細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷，最終造成細(xì)胞功能紊亂以及細(xì)胞凋亡增加[3]。丙泊酚是臨床常用麻醉藥物，具有起效快、安全性高等特點(diǎn)。更為值得關(guān)注的是，丙泊酚還具有抗氧化應(yīng)激的功能，并且在血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中的作用已獲得驗(yàn)證[4]。然而，目前關(guān)于丙泊酚在成骨細(xì)胞中的抗氧化應(yīng)激特性尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文擬研究丙泊酚對(duì)高糖誘導(dǎo)原代成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，為高血糖所致骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的預(yù)防與治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)于Hyclone公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Dojindo Molecular Technologies公司；ROS檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20170115)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；丙泊酚(批號(hào)：01708271)購(gòu)自北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司；葡萄糖購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；0.25%胰酶購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；新生SD仔鼠購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心；EPICS XL流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2原代成骨細(xì)胞的提取與培養(yǎng) 取新生SD仔鼠，應(yīng)用顱骨片組織培養(yǎng)法提取原代成骨細(xì)胞[5]。將SD仔鼠脫頸處死，用乙醇消毒3次，超凈臺(tái)內(nèi)完整分離顱骨并去凈周?chē)浗M織，用PBS液將顱骨片沖洗干凈后剪成1 mm×1 mm大小，用0.25%胰酶消化10 min，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，將處理后小骨片轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中均勻鋪開(kāi)，培養(yǎng)皿放置細(xì)胞孵箱培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液，隔天換液1次，顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。取第2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理 按照處理方法不同將原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)分為高糖組、丙泊酚組和對(duì)照組。3組均用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組的培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖；丙泊酚組的培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖和30 mg/ml丙泊酚。

1.4CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活力 取原代成骨細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種2×103～3×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)第1、3天分別于每組培養(yǎng)細(xì)胞中取5個(gè)孔，每孔加入CCK-8液100 μl后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。然后取出培養(yǎng)板，置于酶標(biāo)儀中，檢測(cè)450 nm的OD值并讀數(shù)，每組5個(gè)讀數(shù)求平均值。

1.5細(xì)胞凋亡測(cè)定 取原代成骨細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h消化收集各組內(nèi)(每組重復(fù)3孔)培養(yǎng)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞3次以后，在細(xì)胞中添加Loading Buffer 500 μl，充分混合，添加PI和Annexin V-FITC染液并混勻，用EPICS XL流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，每組3個(gè)計(jì)數(shù)求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取原代成骨細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后消化收集各組內(nèi)(每組重復(fù)3孔)培養(yǎng)細(xì)胞到1.5 ml離心管中并用PBS液沖洗3遍，適量體積RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并用BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。用10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳。蛋白與4×Loading Buffer按照體積比4∶1混合以后置于100℃孵育5 min。將蛋白樣品添加到上樣孔內(nèi)，Marker上樣量為10 μl，接通電源(通常25 mA)，上層膠電壓為120 V，下層膠電壓為160 V，大約90 min后可見(jiàn)藍(lán)色線(xiàn)條移至玻璃板底端，提示電泳結(jié)束，關(guān)閉電源。準(zhǔn)備6張7 cm×9 cm的濾紙和1張大小合適的PVDF膜，使用前先用甲醇活化PVDF膜。將分離膠小心剝離并蓋在濾紙上，并把膜蓋在膠上，去除氣泡后在膜上面蓋3張濾紙，去除氣泡，將另一海綿墊蓋上。200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，然后將轉(zhuǎn)好的膜取出并在室溫條件下脫色搖床上用5%脫脂牛奶(0.5% TBST配制)封閉1 h。用TBST溶解的5%脫脂牛奶稀釋一抗，稀釋比例為1∶300，4℃條件下孵育過(guò)夜。用TBST在室溫條件下脫色搖床上洗3次，每次5 min。用TBST稀釋二抗3000倍，孵育30 min，用TBST在室溫條件下脫色搖床上洗3次，每次5 min。將試劑ECLA、ECLB在離心管中以相同體積混合，PVDF膜蛋白面朝上并與上述混合液充分接觸1～2 min，然后去盡殘留液體，包好放入暗匣里進(jìn)行曝光。用顯影劑和定影劑進(jìn)行顯影及定影，調(diào)整曝光條件，掃描膠片，Alpha軟件處理后系統(tǒng)分析各個(gè)條帶的光密度值，以β-actin作為參照。

1.7ROS表達(dá)水平檢測(cè) 按照之前分組方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后消化收集各組內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量，ROS表達(dá)水平用熒光強(qiáng)度表示。

2 結(jié)果

2.1SD仔鼠原代成骨細(xì)胞培養(yǎng) 按照顱骨片組織培養(yǎng)法提取SD仔鼠原代成骨細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)3～5 d后可見(jiàn)原代成骨細(xì)胞從顱骨片邊緣長(zhǎng)出，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形。見(jiàn)圖1。

圖1 顱骨邊緣生長(zhǎng)的原代成骨細(xì)胞(標(biāo)尺：100 μm，陰影部分為顱骨片)

2.2細(xì)胞增殖活力檢測(cè) CCK-8法測(cè)定450 nm的OD值，檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。培養(yǎng)第1天，3組原代成骨細(xì)胞增殖活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)第3天，對(duì)照組和丙泊酚組原代成骨細(xì)胞增殖活力明顯優(yōu)于高糖組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 3組原代成骨細(xì)胞增殖活力的OD值比較

高糖組培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖，丙泊酚組培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖和30 mg/ml丙泊酚，對(duì)照組不做任何處理；與高糖組比較，aP<0.05

2.3細(xì)胞凋亡率比較 高糖組原代成骨細(xì)胞的凋亡率為(35.68±3.35)%、丙泊酚組為(19.03±2.27)%、對(duì)照組為(7.21±1.03)%。與對(duì)照組比較，高糖組原代成骨細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)。與高糖組比較，丙泊酚組原代成骨細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 3組原代成骨細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞分析圖

高糖組培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖，丙泊酚組培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖和30 mg/ml丙泊酚，對(duì)照組不做任何處理

2.4Caspase-3蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 高糖組原代成骨細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平為0.50±0.04、丙泊酚組為0.28±0.02、對(duì)照組為0.27±0.03。與對(duì)照組比較，高糖組原代成骨細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與高糖組比較，丙泊酚組原代成骨細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 3組原代成骨細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)水平

高糖組培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖，丙泊酚組培養(yǎng)液加入25.5 mmol/L葡萄糖和30 mg/ml丙泊酚，對(duì)照組不做任何處理

2.5ROS熒光強(qiáng)度檢測(cè) 高糖組原代成骨細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度水平為463.25±45.37、丙泊酚組為219.18±23.56、對(duì)照組為107.53±14.67。與對(duì)照組比較，高糖組原代成骨細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度水平明顯升高(P<0.05)。與高糖組比較，丙泊酚組原代成骨細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度水平明顯降低(P<0.05)。

3 討論

近年來(lái)隨著對(duì)氧化應(yīng)激研究的不斷深入，學(xué)者們對(duì)其在疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起的重要作用有了新的認(rèn)識(shí)。氧化應(yīng)激源于細(xì)胞自身的代償性反應(yīng)，細(xì)胞通過(guò)還原反應(yīng)，將分子氧變成水而產(chǎn)生能量，此過(guò)程中局部會(huì)產(chǎn)生少量ROS[6]。ROS主要產(chǎn)自過(guò)氧化物酶體脂肪酸、線(xiàn)粒體電子傳遞鏈、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞色素P450[7]。ROS在生理水平對(duì)細(xì)胞有益，且由于大部分細(xì)胞具有抗氧化和修復(fù)系統(tǒng)，故能耐受一定程度的氧化應(yīng)激。而當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS水平持續(xù)上升并超過(guò)了細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的防御能力，則將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。此外，ROS還可直接破壞DNA及維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的蛋白質(zhì)和磷脂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。ROS損傷細(xì)胞的機(jī)制復(fù)雜，但其主要是通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄因子、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種途徑來(lái)?yè)p傷細(xì)胞[11]。

氧化應(yīng)激對(duì)于成骨細(xì)胞的增殖與分化具有重要意義。細(xì)胞內(nèi)的ROS水平直接影響成骨細(xì)胞的存活以及功能[12]。當(dāng)ROS在細(xì)胞內(nèi)大量蓄積時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而激活下游執(zhí)行凋亡的因子Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。而Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，當(dāng)Caspase-3蛋白表達(dá)增加時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。

在臨床上，大部分糖尿病患者都伴有骨量減少和骨密度降低，這與局部微循環(huán)條件較差相關(guān)，但其根源在于高血糖所誘發(fā)的氧化應(yīng)激。糖尿病患者由于體內(nèi)長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，易誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致多器官功能障礙。在骨骼系統(tǒng)，糖尿病可致骨生成和吸收代謝紊亂，繼而誘發(fā)骨量降低，最終引起骨質(zhì)疏松及骨慢性感染和炎癥等并發(fā)癥。在口腔科，高血糖所致氧化應(yīng)激反應(yīng)可直接導(dǎo)致種植體周?chē)莵G失、種植體周?chē)椎萚15]。有相關(guān)研究表明，高糖條件下，成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖分化受到顯著抑制，其機(jī)制在于MC3T3-E1成骨細(xì)胞系中線(xiàn)粒體膜電位相降低、Caspase-3活性增強(qiáng)、氧化應(yīng)激水平上升，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加[16]。成骨細(xì)胞是骨細(xì)胞的前體，對(duì)于骨形成具有極其重要的作用；成骨細(xì)胞的增殖與凋亡對(duì)于骨界面的愈合極為重要[17]。

丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥物之一，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心、腦、腎、肝臟等重要臟器具有一定的保護(hù)作用；此外，丙泊酚還在缺血再灌注、動(dòng)脈粥樣硬化等氧化應(yīng)激性疾病中發(fā)揮了一定的抗氧化作用，從而能夠減輕細(xì)胞的損傷以及減少凋亡[18-19]。另外還有文獻(xiàn)研究表明，丙泊酚具有抑制肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的能力[20-26]。

本研究結(jié)果表明，高糖培養(yǎng)條件下，原代成骨細(xì)胞增殖減少，凋亡顯著增加，細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度水平明顯升高，Caspase-3蛋白表達(dá)增高。提示高糖能夠誘導(dǎo)原代成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡。而加入丙泊酚，能夠明顯促進(jìn)高糖培養(yǎng)條件下原代成骨細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度和Caspase-3蛋白表達(dá)水平也顯著降低。該結(jié)果提示丙泊酚可通過(guò)降低氧化應(yīng)激減少高糖對(duì)原代成骨細(xì)胞的損傷作用，對(duì)于高糖條件下機(jī)體骨形成具有一定的保護(hù)作用。另外，本研究中丙泊酚降低氧化應(yīng)激的機(jī)制尚未完全明確，下一步將深入研究高血糖所引起的ROS相關(guān)機(jī)制以及丙泊酚在其中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，從而為高血糖所致骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病的預(yù)防與治療提供新的途徑。

綜上所述，高糖可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，增加細(xì)胞凋亡；丙泊酚可以減輕高糖所致成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。