微孔板法在一線抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值

楊翰 楊靜芬 伍浩 崔曉利 黨麗云

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的多器官受損的傳染病，主要以肺結(jié)核為主。藥物化療是其主要治療方式，但因近年來(lái)耐藥結(jié)核病的發(fā)生率不斷上升，使結(jié)核病的防治異常嚴(yán)峻。WHO[1]發(fā)布的《2019全球結(jié)核病報(bào)告》指出，2018年全球共有186 772例耐多藥及利福平耐藥結(jié)核病(multidrug- and rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)患者，明顯高于2017年(160 684例)。因此，藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)在結(jié)核病的治療中起到了至關(guān)重要的作用。目前，臨床檢測(cè)結(jié)核病耐藥性的主要方法包括分子藥敏試驗(yàn)及表型藥敏試驗(yàn)，盡管WHO推薦表型藥敏試驗(yàn)中的比例法與BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960” 法)，但由于比例法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，MGIT 960法檢測(cè)藥物種類較少，使得可大大提升檢測(cè)藥物種類及明顯縮短報(bào)告時(shí)間的微孔板法被廣泛應(yīng)用[2-6]，但其檢測(cè)結(jié)果的可靠性仍需大量臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。本研究以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，分析微孔板法藥敏試驗(yàn)對(duì)鏈霉素(Sm)、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)等4種一線抗結(jié)核藥物檢測(cè)的符合率、一致性等指標(biāo)，為微孔板法藥敏試驗(yàn)的臨床意義及價(jià)值提供參考依據(jù)。

材料和方法

一、材料收集

收集2019年1—6月西安市胸科醫(yī)院收治的經(jīng)MGIT 960法培養(yǎng)陽(yáng)性的1086份標(biāo)本，選擇其中經(jīng)菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌且同時(shí)對(duì)鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇行MGIT 960 法和微孔板法藥敏試驗(yàn)的331份菌液，分析兩種試驗(yàn)方法的檢測(cè)情況；并以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估微孔板法藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)效能，對(duì)結(jié)果不一致的菌液以熔解曲線法檢測(cè)耐藥基因予以核實(shí)。

二、研究方法

1.儀器與試劑：Lad-Aid 824s 核酸提取儀(廈門(mén)致善生物科技有限公司)，SLAN系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(廈門(mén)致善生物科技有限公司)，YK-009 自動(dòng)加樣系統(tǒng)(珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)，BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)，結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒(鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇，批號(hào) 19012101；廈門(mén)致善生物科技有限公司)，Lad-Aid 824結(jié)核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑(批號(hào)190111，廈門(mén)致善生物科技有限公司；為PCR體系中的引物、dNTP、Mg2+等物質(zhì)，本研究有MixA、MixB)，MGIT 960 液體藥敏試劑盒(批號(hào)：804944；美國(guó)BD公司)，分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：19011002，珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)。

2.MGIT 960 法藥敏試驗(yàn)的操作方法[7]：(1)菌液準(zhǔn)備：取MGIT 960系統(tǒng)報(bào)告陽(yáng)性且菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌液，以報(bào)告陽(yáng)性當(dāng)天記為第0天，若在第1、2天可直接進(jìn)行工作菌液藥敏試驗(yàn)接種，若在第3～5天則需用滅菌生理鹽水按照1∶5(1 ml菌懸液、4 ml生理鹽水)稀釋后的工作菌液進(jìn)行藥敏試驗(yàn)接種。(2)含藥培養(yǎng)基準(zhǔn)備：于MGIT 960試劑盒取5只培養(yǎng)管，第1管標(biāo)記GC(空白對(duì)照)，其余4管分別標(biāo)記為Sm(1 μg/ml)、INH(0.1 μg/ml)、RFP(1 μg/ml)、EMB(5 μg/ml)。無(wú)菌操作下每管加入0.8 ml增菌劑，在相應(yīng)含藥標(biāo)記管加入100 μl相應(yīng)藥物干粉，并以4 ml滅菌蒸餾水溶解；空白對(duì)照管內(nèi)加入0.5 ml的1∶100倍稀釋的工作菌液(0.1 ml菌液、10 ml滅菌生理鹽水)，其余4管含藥培養(yǎng)基也加入上述工作菌液0.5 ml，蓋緊螺旋蓋并混勻。(3)結(jié)果報(bào)告：將上述培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)，等待機(jī)器報(bào)告結(jié)果。

3.微孔板法藥敏試驗(yàn)的操作方法[8]：備好藥敏試驗(yàn)對(duì)應(yīng)菌株和試劑，使用超聲分散儀將菌液磨菌比濁至1 mg/ml，取出凍干雜菌抑制劑，將無(wú)菌稀釋液全部加入后混勻，取出陰性對(duì)照管和藥敏培養(yǎng)基放置至接近室溫，用加樣槍分別吸取30 μl抑制劑加入陰性對(duì)照管中，吸取100 μl抑制劑加入藥敏培養(yǎng)基中，用加樣槍吸取菌液100 μl加入藥敏培養(yǎng)基后上機(jī)，儀器加樣完成后取出藥敏測(cè)試板，蓋上蓋子，用透明膠帶沿周邊封1圈后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10～21 d內(nèi)觀察結(jié)果。微孔板藥敏試驗(yàn)中4種藥品的耐藥濃度分別為鏈霉素：中敏4 μg/ml，耐藥8 μg/ml；異煙肼：耐藥2 μg/ml；利福平：中敏 4 μg/ml，耐藥8 μg/ml；乙胺丁醇：中敏2.5 μg/ml，耐藥5 μg/ml。

4. 熔解曲線法的操作方法：(1)核酸提取：吸取MGIT 960法報(bào)告陽(yáng)性菌液750 μl至1.5 ml EP管中，99 ℃金屬浴15 min。按照Lad-Aid 824結(jié)核分枝桿菌核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將獲得的DNA溶液以12 000×g離心1 min，收集上清液用于后續(xù)試驗(yàn)。(2)試劑配制：取出保存在-20 ℃的相應(yīng)藥物試劑盒平衡至室溫，將MixA、MixB渦旋振蕩充分混勻，分別吸取19.6 μl MixA、MixB，與0.4 μl酶液(含反轉(zhuǎn)錄酶、T7聚合酶)混合后加入0.2 ml離心管中。在相應(yīng)0.2 ml離心管中加入5 μl 提取的DNA上清液，瞬時(shí)離心，彈去氣泡，上機(jī)檢測(cè)。(3)結(jié)果判讀及分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以MGIT 960法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算微孔板法對(duì)鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇等4種藥品的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率及Kappa值，其中Kappa值在0.00～0.20為極低一致性，0.21～0.40為一般一致性，0.41～0.60為中等一致性，0.61～0.80為高度一致性，0.81～1.00為幾乎完全一致[9-10]。

結(jié) 果

一、微孔板法檢測(cè)結(jié)果

兩種方法的檢測(cè)結(jié)果為耐藥、中敏及敏感，本結(jié)果中的“中敏”納入“敏感”計(jì)算檢測(cè)效能。以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)4種藥品檢測(cè)的符合率均在97%以上；除乙胺丁醇的敏感度為66.7%，其他3種藥品間的敏感度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均較高。一致性檢測(cè)中，除乙胺丁醇的Kappa值(0.72)為“高度一致性”外，鏈霉素、異煙肼、利福平等3種藥品的Kappa值(分別為0.93、0.94、0.95)均為“幾乎完全一致”。

表1 以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)分析微孔板法對(duì)4種一線抗結(jié)核藥品的耐藥性檢測(cè)效能

表2 兩種藥敏試驗(yàn)不一致結(jié)果與熔解曲線結(jié)果對(duì)比分析

二、微孔板法與MGIT 960法的不同結(jié)果分析

微孔板法與MGIT 960法檢測(cè)4種藥品均一致的耐藥性結(jié)果(包括敏感或耐藥)分別為鏈霉素321份(97.0%)，異煙肼323份(97.6%)，利福平325份(98.2%)，乙胺丁醇315份(95.2%)。兩者結(jié)果不一致(包含微孔板法的“中敏”結(jié)果)主要集中在MGIT 960法為耐藥而微孔板法為敏感或中敏(33份)，見(jiàn)表2。經(jīng)熔解曲線耐藥基因分析后結(jié)果顯示，微孔板法為中敏而MGIT 960法為耐藥者10份(3.0%，10/331)，耐藥基因均為突變；而微孔板法為中敏而MGIT 960法為敏感僅1份(0.3%，1/331)，且耐藥基因?yàn)橥蛔?；微孔板法為敏感而MGIT 960法為耐藥者23份(6.9%，23/331)，耐藥基因?yàn)殒溍顾睾彤悷熾乱砸吧洼^多(分別為6/8，4/5)，利福平和乙胺丁醇以突變型較多(分別為3/3，7/7)，具體見(jiàn)表2。

討 論

目前，結(jié)核分枝桿菌表型藥敏試驗(yàn)的方法以WHO推薦的比例法及MGIT 960法為主。日常開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室工作中，比例法操作較為復(fù)雜，單個(gè)樣本的檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，操作人員往往對(duì)大樣本量處理較為困難，且結(jié)果報(bào)告需要4周；MGIT 960法操作較為簡(jiǎn)單，結(jié)果報(bào)告時(shí)間短，但對(duì)菌液的濁度較難控制，容易造成假陰性結(jié)果[8]，且目前僅對(duì)一線抗結(jié)核藥物應(yīng)用較多。故為了適應(yīng)臨床需求，多種微孔板法藥敏檢測(cè)試劑盒被不斷推出，較為成熟的有賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)、珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司、鄭州安圖生物工程股份有限公司等生產(chǎn)的試劑盒，本研究?jī)H采用珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司分枝桿菌微孔板法藥敏檢測(cè)試劑盒(培養(yǎng)法)，該試劑盒可檢測(cè)16種一、二線抗結(jié)核藥物，其中4種一線藥物各4個(gè)藥物梯度，12種二線藥物各2個(gè)藥物梯度(中敏與耐藥MIC濃度)。與MGIT 960法相比，微孔板法是將被檢測(cè)藥物提前包被在96孔板中，由操作人員或自動(dòng)移液平臺(tái)將定量的菌懸液接種到96孔板中即可，操作較為簡(jiǎn)便，而MGIT 960法需要人工配置藥物到培養(yǎng)管中，增加了操作程序以及污染風(fēng)險(xiǎn)。

微孔板法作為“十一五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)的科研轉(zhuǎn)化成果，能夠更快速、更簡(jiǎn)便的檢測(cè)出4種一線抗結(jié)核藥物和12種二線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有利于早期篩查耐藥性。蘇碧儀等[11]報(bào)道了微孔板法在部分二線抗結(jié)核藥物中的較高應(yīng)用價(jià)值，與MGIT 960法具有較高的符合度，其檢測(cè)異煙肼、利福平耐藥性的敏感度和特異度與傳統(tǒng)的比例法也有較高一致性，且與耐藥基因相關(guān)檢測(cè)也有較高符合率。本研究以MGIT 960法為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比了微孔板法對(duì)一線抗結(jié)核藥物耐藥性檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率、Kappa值等指標(biāo)，結(jié)果顯示微孔板法檢測(cè)4種一線抗結(jié)核藥物耐藥性具有較好的敏感度、特異度，且與MGIT 960法一致率較高，可以滿足臨床應(yīng)用，且兩種方法不一致結(jié)果主要為MGIT 960法為耐藥但微孔板法為中敏或敏感，提示微孔板法較MGIT 960法可以檢測(cè)出低濃度耐藥的情況。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)，MGIT 960法確定的敏感菌株會(huì)存在部分基因突變，表現(xiàn)為這部分患者一線抗結(jié)核藥物的治療效果較差，為避免過(guò)早放棄使用異煙肼、利福平等核心一線藥物，可以利用微孔板法發(fā)現(xiàn)低濃度耐藥的作用，為臨床藥物的使用劑量提供參考[12-13]。進(jìn)一步經(jīng)熔解曲線法核查耐藥基因，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微孔板法為“中敏”時(shí)耐藥基因?yàn)橥蛔冃停划?dāng)微孔板法為“敏感”時(shí)，鏈霉素與異煙肼的耐藥基因多為野生型，而利福平與乙胺丁醇的耐藥基因則全部為突變型。但通過(guò)對(duì)耐藥基因的核查，提示當(dāng)使用不同表型藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)時(shí)，如果出現(xiàn)與耐藥基因結(jié)果不一致，應(yīng)進(jìn)一步復(fù)查表型藥敏檢測(cè)為敏感而耐藥基因?yàn)橥蛔兊木海悦鞔_表型藥敏試驗(yàn)的結(jié)果是否可靠。

針對(duì)本研究的檢測(cè)結(jié)果，筆者認(rèn)為可能存在以下不足：(1)本研究采用的試劑盒可報(bào)告MIC值，但與抗生素藥品的最低抑菌濃度檢測(cè)法(MIC法)有所區(qū)別，在一線抗結(jié)核藥物中有4個(gè)藥物梯度，二線抗結(jié)核藥物僅有中敏與耐藥2個(gè)藥物濃度值且不連續(xù)，因此在報(bào)告二線藥物時(shí)僅為參考性最終結(jié)論，不能以報(bào)告的MIC值判斷藥物的抑菌濃度。(2)微孔板法操作需要嚴(yán)格無(wú)菌操作，若出現(xiàn)單孔污染時(shí)應(yīng)當(dāng)分析是否影響整體試驗(yàn)結(jié)果，特別是在二線藥物僅有2個(gè)藥物梯度的前提下，隨機(jī)的單孔污染都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行復(fù)檢來(lái)保證結(jié)果的可靠性。(3)本研究采用的試劑盒配備的藥敏判讀軟件，在正常輸入結(jié)果后，儀器判讀的MIC值為細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度最高孔，而非最低抑菌濃度孔，實(shí)驗(yàn)室操作人員應(yīng)注意判讀標(biāo)準(zhǔn)，以避免發(fā)布錯(cuò)誤報(bào)告，影響患者治療。(4)在檢測(cè)過(guò)程中，出現(xiàn)部分96孔板孔序倒置的問(wèn)題，例如：原A、B列的陽(yáng)性對(duì)照孔出現(xiàn)在K、L列(該藥敏板在生產(chǎn)時(shí)存在孔序倒置問(wèn)題)，表明此次試驗(yàn)失敗，需重新進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

綜上所述，微孔板法藥敏試驗(yàn)對(duì)一線抗結(jié)核藥物的檢測(cè)與MGIT 960法具有較高的一致性，可基本滿足臨床需求，但實(shí)驗(yàn)室操作人員需嚴(yán)格把控檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量以及結(jié)果審核，避免出現(xiàn)錯(cuò)誤報(bào)告。