駿棗精油的超臨界CO2萃取工藝及其組成分析

徐恒，蒲云峰，奚倩，黃英，侯旭杰

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill．），又名大棗、華棗、干棗等，是鼠李科棗屬植物的成熟果實(shí)，除供鮮食外，多制成干棗、棗泥、棗酒、棗飲料等產(chǎn)品[1-3]。在我國，大棗的栽培歷史悠久，種植區(qū)域廣泛，有700余個品種，如灰棗、駿棗、金絲小棗等[4-5]。紅棗不僅富含多糖、三萜、氨基酸、環(huán)磷酸腺苷等生物活性成分，而且還擁有獨(dú)特的焦糖香[6-7]。紅棗精油是利用不同加工工藝技術(shù)從紅棗中提取獲得的，其純度高、香型逼真且香氣強(qiáng)度高[8]。馥郁的棗香氣味，可作為天然食品添加劑的來源，具有增進(jìn)食欲、促進(jìn)消化液的分泌等作用，在食品、藥品、保健品、煙草及化妝品當(dāng)中應(yīng)用廣泛，具有極大的市場應(yīng)用前景[9]。

目前紅棗精油的制備多采用有溶劑萃取或水蒸氣蒸餾等方法，但其產(chǎn)物香型多變、萃取率低、溶劑殘留大、香氣強(qiáng)度低；而超臨界二氧化碳萃取適于不穩(wěn)定天然產(chǎn)物的分離精制，具有萃取純度高、無毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。

近年來，對紅棗香味的研究大多集中于溫度對香味物質(zhì)形成的影響，有關(guān)紅棗香氣自身的提取分析鑒別相關(guān)研究較少[13-14]。本研究優(yōu)化了超臨界二氧化碳萃取紅棗精油工藝，采用頂空-固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）對駿棗精油揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行了分離萃取及分析檢測。其結(jié)果為紅棗天然食品添加劑的開發(fā)及香味評價提供理論依據(jù)，拓展了紅棗開發(fā)新方向，提高了紅棗的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆駿棗（干棗）：新疆阿克蘇市皖疆農(nóng)民生產(chǎn)合作社，2018年10月當(dāng)季收獲。

CO2（純度99.8%）：新疆阿拉爾市小李氧氣店；乙醇（國產(chǎn)分析純，純度99.8%）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spe-ed SFE-2型超臨界萃取裝置：美國ASI公司；7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；SAAB-57328U SPME手動進(jìn)樣柄、手動萃取頭（50/30UM DVB/CAR on PDMS）：上海安普公司；低溫恒溫循環(huán)器：南京新辰生物科技有限公司；DZF-6210電熱恒溫烘箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CFB高速萬能粉碎機(jī)、AR2140電子天平：奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；Talboys數(shù)顯型磁力加熱攪拌器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

挑選大小均勻一致無機(jī)械損傷的駿棗，去除果柄、果核，清洗干凈；恒溫60℃烘烤24h后升溫至120℃繼續(xù)烘烤0.5 h；冷卻后粉碎；過40目篩；得駿棗干果粉末，－20 ℃密封避光保存[15]。

1.3.2 駿棗精油提取制備

稱取駿棗干粉200.0 g，裝入1.0 L的萃取釜中，以無水乙醇為夾帶劑，打開冷卻系統(tǒng)，設(shè)定萃取釜壓力及溫度，打開CO2閥門，檢漏后保持預(yù)設(shè)溫度和壓力，調(diào)節(jié)夾帶劑泵流速，開始加壓萃取。萃取達(dá)到預(yù)定時間，收集提取物，稱量瓶稱重，計算紅棗精油的得率[16]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

采用控制變量法，選取對超臨界CO2萃取精油效果影響較大的因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以精油得率為考察指標(biāo)。預(yù)設(shè)萃取時間分別為 0.5、1、2、3、4、5、6、7 h，萃取壓力分別為 20、25、30、35 MPa，萃取溫度分別為 25、30、35、40、45 ℃，夾帶劑種類為水、乙醇、甲醇，夾帶劑流速分別為 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL/min。在其它因素不變的情況下，考察單個因素對精油得率的影響，每個因素考察3次，取平均值。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化紅棗精油提取條件

對壓力、溫度、夾帶劑流速3個因素進(jìn)行單因素分析，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定出較適宜的條件，以駿棗精油提取得率為評價標(biāo)準(zhǔn)，對壓力、溫度、夾帶劑流速3個因素進(jìn)行L9（33）的正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.3.5 HS-SPME的分離富集

萃取頭老化：在230℃的溫度下，將50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭保持進(jìn)樣狀態(tài)，老化90 min，去除雜質(zhì)，確保無干擾雜峰出現(xiàn)。

將駿棗精油置于15.0 mL玻璃管中，加入攪拌轉(zhuǎn)子，用9.5 mm，pk25玻璃管配套隔墊密封，將其置于數(shù)顯型磁力加熱攪拌器中。在50℃、200 r/min條件下平衡20 min，然后將已老化好的萃取頭安裝在SPME操作平臺上，萃取頭距離玻璃管中距液面1 cm處，萃取30 min，進(jìn)行 GC-MS 分析[17]。

1.3.6 GC-MS紅棗精油成分分析[18-19]

GC條件：VF-WAXms毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；前進(jìn)樣口溫度240℃，升溫程序：起始溫度40℃，保持5 min，以5℃/min升溫速率升至120℃，保持10 min，以8℃/min升溫速率升至180℃，保持10 min，最后以10℃/min升溫速率升至230℃，保持10 min；進(jìn)樣量為 0.8 μL；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣比為 10 ∶1；以He為載氣，流速為0.8 μL/min；時間間隔為1 s。

MS條件：電噴霧離子源（ESI）；電離能為70 eV；接口溫度為240℃；離子源溫度為230℃；四級桿溫度為150℃；掃描范圍m/z 30～450。

1.3.7 定性分析

對檢出成分的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)與NIST.14質(zhì)譜庫的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索和人工分析比對，選擇80%以上的匹配度作為物質(zhì)鑒定依據(jù)，并通過查閱文獻(xiàn)及相關(guān)質(zhì)譜資料，對樣品中各揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行定性分析[20]。用峰面積歸一化法，即以組分峰面積占總峰面積的百分比來計算得到各組分的相對含量[21]。

2 結(jié)果與分析

2．1 萃取條件選擇

2.1.1 夾帶劑對駿棗精油萃取得率的影響

不同夾帶劑對駿棗精油萃取得率的影響見圖1。

由圖1可知，當(dāng)乙醇溶液作夾帶劑時，萃取效果遠(yuǎn)好于水和甲醇做夾帶劑時萃取效果，這與曹艷萍[16]等采用超臨界CO2萃取灘棗精油工藝中，夾帶劑選擇相同。故超臨界萃取駿棗精油夾帶劑選擇乙醇。

圖1 不同夾帶劑對駿棗精油萃取得率的影響Fig.1 Effect of different entrainers on extraction rate of jujube essential oil

2.1.2 時間對駿棗精油萃取得率的影響

不同萃取時間對駿棗精油萃取得率的影響見圖2。

圖2 萃取時間對駿棗精油萃取得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of jujube essential oil

由圖2所示，超臨界萃取初期，駿棗精油的萃取得率隨著時間的增加而迅速增加。當(dāng)萃取時間在0至2 h時萃取率增速最快，此后萃取率增幅降低，萃取3 h后其萃取量基本保持不變，這是因?yàn)檩腿「序E棗的精油含量有限，經(jīng)過3 h的萃取已基本分離完全。即超臨界CO2萃取駿棗精油萃取時間定為3 h為宜。

2.1.3 壓力對駿棗精油萃取得率的影響

不同萃取壓力對駿棗精油萃取得率的影響見圖3。

由圖3所示，不同萃取壓力對萃取駿棗精油含量有所不同，壓力在25 MPa時萃取率達(dá)到最大。初期隨著萃取釜壓力的增大，提高了流體密度，增加CO2對精油的溶解度，從而提高了萃取率，但當(dāng)壓力超過25 MPa后，隨著壓力進(jìn)一步增大，萃取釜內(nèi)壓力過高導(dǎo)致棗粉過度黏結(jié)，影響精油的萃取效果。因此，選取25 MPa為萃取壓力較好。

2.1.4 溫度對駿棗精油萃取得率的影響

不同萃取溫度對駿棗精油萃取得率的影響見圖4。

圖3 萃取壓力對駿棗精油萃取得率的影響Fig.3 Effect of extraction pressure on extraction yield of jujube essential oil

圖4 萃取溫度對駿棗精油萃取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of jujube essential oil

由圖4所示，在壓力一定的條件下，駿棗精油的得率隨萃取溫度的提高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到35℃時萃取得率達(dá)到1.162%。溫度升高，CO2分子熱運(yùn)動加快，溶質(zhì)的傳質(zhì)系數(shù)增大、揮發(fā)性和擴(kuò)散速度都有所提高，有利于香味溶質(zhì)的萃取。但是，當(dāng)溫度繼續(xù)加大，CO2分子間間距進(jìn)一步增大，密度降低，分子間作用力變小，溶解能力降低，同時萃取釜中溫度與壓力構(gòu)建的超臨界平衡點(diǎn)被打破，萃取率也會降低，且過高的溫度會導(dǎo)致精油中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)損失加劇[22]。因此，選取35℃為萃取溫度較好。

2.1.5 夾帶劑流速對駿棗精油萃取得率的影響

不同夾帶劑流速對駿棗精油萃取得率的影響見圖5。

由圖5所示，在壓力、溫度一定的條件下，駿棗精油的得率會隨著夾帶劑流速的變化而變化，在夾帶劑未進(jìn)入前其萃取率為0.630%，當(dāng)夾帶劑流速緩慢增加時，萃取得率呈現(xiàn)先減小再增加而后又降低的變化。其夾帶劑流速達(dá)到0.3 mL/min時，萃取得率達(dá)到最大。夾帶劑對超臨界CO2溶解能力的影響比較復(fù)雜，當(dāng)加入一定量無水乙醇作夾帶劑時，可改變超臨界CO2的極性，拓寬其溶解范圍，改變?nèi)苜|(zhì)分子間范德華力，增強(qiáng)CO2的溶解力，使其萃取率提高。但當(dāng)夾帶劑使用量較低時，對CO2的極性影響不顯著，精油萃取率稍稍有所降低；當(dāng)夾帶劑使用量超過臨界點(diǎn)時，反而造成CO2密度下降其溶解度降低[23]。因此，選取0.3 mL/min無水乙醇作夾帶劑時萃取效率較好。

圖5 夾帶劑流速對駿棗精油含量的影響Fig.5 Effect of entrainer flow rate on the content of jujube essential oil

2.2 正交試驗(yàn)

萃取時間對萃取效果影響差異不大，而夾帶劑的影響較為明顯，因此固定萃取時間為3 h，以無水乙醇作夾帶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑流速相互之間對萃取率的影響，設(shè)計正交試驗(yàn)見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表3。

表2 超臨界CO2萃取優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for supercritical CO2extraction conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

由表2可知，比較直觀分析結(jié)果中極差R值，各因素對萃取精油效果的影響強(qiáng)弱順序?yàn)锳＞B＞C。由表3分析可得A因素對得率的影響顯著，B、C因素對得率無顯著性，兩種分析結(jié)果一致，即萃取壓力影響最顯著，溫度次之，夾帶劑流速對精油的提取影響最小。

由極差分析法計算結(jié)果K值可知，正交因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C2，即萃取壓力25 MPa，萃取溫度35℃，夾帶劑流速3 mL/min。加做驗(yàn)證性試驗(yàn)，取3次試驗(yàn)結(jié)果平均值，精油萃取率為1.196%。而從表2中可直觀地可以找出9個處理中最優(yōu)水平組合為4號處理，即A2B1C2，萃取壓力25 MPa，萃取溫度32℃，夾帶劑流速3 mL/min，其萃取率達(dá)到1.224%。比正交最優(yōu)組合處理精油萃取量大，即最優(yōu)萃取工藝條件為確定為A2B1C2。

2.3 駿棗精油的HS-SPME-GC-MS成分分析

利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對駿棗精油進(jìn)行揮發(fā)性香氣物質(zhì)測定，其總離子流圖如圖6所示。

圖6 GC-MS測定駿棗精油揮發(fā)性成分色譜流出圖Fig.6 GC-MS determination of chromatographic efflux of volatile constituents of jujube essential oil

由圖6可知色譜圖峰形窄而尖，峰個數(shù)多，說明該條件對駿棗精油揮發(fā)性成分萃取效果較好。揮發(fā)性香氣物質(zhì)分析如表4所示。

由圖6、表4可知，從駿棗精油揮發(fā)性物質(zhì)中共分離檢測到68種物質(zhì)，其中確定結(jié)構(gòu)的有59種，占總峰面積的91.737%，酸類、烷烴類、酮類和酯類相對含量較高，是構(gòu)成駿棗精油香味主要組分。其中酸類化合物19種，相對含量48.872%，主要是稍微帶有刺激氣味的乙酸、正癸酸以及含有杏仁氣味苯甲酸含量較高，其次是果香味的月桂酸和呈現(xiàn)脂肪味、難聞氣味的己酸、壬酸。酸類化合物占比較高可能是駿棗在上糖心過程或采摘后儲藏過程中，由發(fā)酵產(chǎn)生的部分乙酸，也可能是烘干及超臨界萃取過程中不飽和脂肪酸熱氧化分解的產(chǎn)物，這與駿棗果肉口感發(fā)酸結(jié)果相符[24-25]；酯類物質(zhì)6種，相對含量5.374%，以香料溶劑甲基丙烯酸異癸酯為主，酯類的種類和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較少，可能是高溫使酯合酶失活以及與美拉德反應(yīng)有關(guān)[24]；醇類物質(zhì)6種，相對含量3.464%，含有焦糖香味的麥芽醇占比較高，其它醇類物質(zhì)多給精油提供花香、醇香等風(fēng)味，一般是脂肪氧化酶等生物酶作用下不飽和脂肪酸和一些氨基酸直接形成的醇類香味物質(zhì)[26]；醛類物質(zhì)3種，相對含量3.488%，具有杏仁氣味的糠醛和苯甲醛，以及焦糖香味的5-羥甲基糠醛。糠醛是抗壞血酸在加熱，有氧的條件下降解生成的醛類物質(zhì)[27]，5-羥甲基糠醛是擬除蟲菊酯烯丙菊酯和烯炔菊酯的中間體，是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，一般多作煙用香精等[6]；酮類物質(zhì)4種，相對含量6.877%，具有奶香味的3-羥基-2-丁酮含量最多，醛酮類揮發(fā)性物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少，可能是因?yàn)榕c其它化合物結(jié)合更強(qiáng)；烷烴類物質(zhì)12種，相對含量19.485%，研究證明脂肪烷烴物質(zhì)的生成其重要途徑之一是美拉德反應(yīng)，但這些烴類物質(zhì)的形成機(jī)制以及對棗精油香味構(gòu)成的影響有待進(jìn)一步研究[28-30]；酚類物質(zhì)2種，相對含量0.753%；其它化合物分別為7種，相對含量3.424%。

表4 駿棗精油揮發(fā)性物質(zhì)組成及含量Table 4 Composition and content of volatile substances in of the jujube essential oil

續(xù)表4 駿棗精油揮發(fā)性物質(zhì)組成及含量Continue table 4 Composition and content of volatile substances in of the jujube essential oil

續(xù)表4 駿棗精油揮發(fā)性物質(zhì)組成及含量Continue table 4 Composition and content of volatile substances in of the jujube essential oil

3 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化超臨界二氧化碳萃取駿棗精油工藝條件，最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇作攜帶劑，萃取壓力25 MPa，萃取溫度32℃，夾帶劑流速0.3 mL/min，萃取時間3 h，駿棗精油的萃取率可達(dá)1.224%。經(jīng)方差分析和試驗(yàn)驗(yàn)證，此工藝參數(shù)合理可行，與曹艷萍等[16]采用超臨界CO2萃取灘棗精油工藝得率1.51%相比略少，但兩者選用原料有所差異，夾帶劑加入方式不同。后續(xù)利用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)對駿棗精油揮發(fā)性香味物質(zhì)組成進(jìn)行分析，共檢出68種物質(zhì)，結(jié)構(gòu)推斷59種，占總峰面積的91.737%，其中主要包括酸類、烷烴類、酮類、酯類以及少量的醛類、醇類等，這與王頡等[31]早年研究棗揮發(fā)油的提取及化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析中物質(zhì)鑒別相似。各類物質(zhì)中焦糖香味的麥芽醇和5-羥甲基糠醛，杏仁氣味苯甲酸和糠醛，以及奶香氣味的3-羥基-2-丁酮都可能是駿棗精油的主要香氣成分。