肝豆靈對高銅負(fù)荷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)干細(xì)胞ROS水平的影響

匡春俊 董婷 周萍 李秀英 田麗偉 黃鵬

【摘?要】?目的：觀察肝豆靈對高銅負(fù)荷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響。方法：75只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，隨機分為對照組，模型組，肝豆靈處理高、中、低劑量組，肝豆靈處理組分別給予1.92g/kg/d、0.96g/kg/d、0.48g/kg/d藥物血清灌胃，對照組以等體積純凈水灌胃，7d后觀察SD大鼠在T臂迷宮試驗中空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化。于無菌條件下取孕14d ICR小鼠胎鼠海馬組織，分為對照組、高銅模型組和高、中、低劑量肝豆靈片處理組，對照組在液體培養(yǎng)基中加入10%的SD大鼠空白血清，模型組用含10%的SD大鼠空白血清銅負(fù)荷培養(yǎng)基培養(yǎng)，肝豆靈低、中、高劑量組予以3種不同劑量配制的10%的肝豆靈藥物血清銅負(fù)荷培養(yǎng)基培養(yǎng)，以流氏細(xì)胞儀檢測神經(jīng)干細(xì)胞ROS水平。結(jié)果：行為學(xué)試驗，模型組和小劑量治療組的進(jìn)入電刺激區(qū)的時間明顯降低，經(jīng)過藥物治療后，進(jìn)入電刺激區(qū)的時間（S）明顯增加。ROS水平檢測，模型組高于對照組（P<0.01），肝豆靈組低于模型組（P<0.05），高于正常組（P<0.05）。結(jié)論：化痰祛瘀方肝豆靈可降低神經(jīng)干細(xì)胞中ROS的水平并改善高銅負(fù)荷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

【關(guān)鍵詞】

Wilson病;認(rèn)知功能;肝豆靈;T臂水迷宮;神經(jīng)干細(xì)胞

【中圖分類號】R285.5???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2020）5-0013-04

Effects of Gandouling on Spatial Learning and Memory Ability

and ROS level of Neural Stem Cells in Copper-stressed Mice

KUANG Chunjun1?DONG Ting2*?ZHOU Ping1?LI Xiuying1?TIAN Liwei1?HUANG Peng2

1. Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China;

2. Encephalopathy Center，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China

Abstract：

Objective To observe the effects of Gandouling on spatial learning and memory in rats with high copper load and the effects of Gandouling on ROS levels in fetal neural stem cells.Method Adaptability of 75 SD rats fed，after 7 days，were randomly divided into control group，model group，hepatic bean spirit high，medium and low dose group，treatment group were given liver beans spirit of 1.92g/kg/d，0.96g/kg/d，0.48g/kg/d drug serum to fill the stomach，the control group with pure water to fill the stomach，such as volume seven days to observe SD rats in T arm maze test the change of spatial learning and memory ability.In a sterile conditions get pregnant 14d fetal rat hippocampus，ICR mice were divided into control group，high copper model group and high，medium and low dose hepatic bean spirit treatment group，control group to join in the liquid medium blank serum，10% of the SD rats model group with blank SD rats serum copper containing 10% load medium，hepatic bean spirit high，medium and low dose group to be three different dose makes up 10% of the cultured liver beans spirit drug serum copper load medium，flow meters cells in detecting neural stem cells ROS levels.Result In the behavioral test，the time to enter the electrical stimulation area in the model group and the low-dose treatment group decreased significantly，and the time to enter the electrical stimulation area（S）increased significantly after drug treatment.ROS level in the model group was higher than that in the control group（P<0.01），lower than that in the model group（P<0.05），and higher than that in the normal group （P<0.05）.Conclusion Gandouling Decoction for Resolving Phlegm and Removing Stasis can reduce ROS level in neural stem cells and improve spatial learning and memory ability of rats with high copper load.

Key?words：Wilson disease;Cognitive function;Gandouling;T-arm water maze;Neural stem cells

Wilson病（Wilsons disease，WD），即肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD），是ATP7B基因缺陷引起的銅代謝障礙疾病。患者因基因缺陷不能清除體內(nèi)多余的銅，使銅離子沉積于腦部、肝臟、腎臟、皮膚、眼部等臟器系統(tǒng)，使各組織臟器銅中毒受損而出現(xiàn)多樣的臨床表現(xiàn)。銅作為強氧化劑，可激活自由基，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[1]，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使神經(jīng)細(xì)胞凋亡。銅沉積腦部，神經(jīng)系統(tǒng)受損，出現(xiàn)進(jìn)行性智力減退[2-3]、精神異常等癥狀。在祖國醫(yī)學(xué)研究中，將WD以認(rèn)知能力下降為主要臨床表現(xiàn)的辨病為“癡呆病”，其中“痰瘀互結(jié)型”易出現(xiàn)認(rèn)知障礙。安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心為WD患者研制的肝豆靈（Gan dou liang，GDL）具有化痰祛瘀作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肝豆靈能夠明顯改善WD患者認(rèn)知障礙[4]，提高患者智力水平。課題組在WD病程研究過程中發(fā)現(xiàn)，NSC是高銅負(fù)荷的重要靶點，肝豆靈能抵抗高銅導(dǎo)致的NSC生長阻礙，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。因此，本研究從動物、分子水平，利用課題組前期體外建立的高銅培養(yǎng)NSC模型[6]，予以藥物“肝豆靈”干預(yù)，觀察胎鼠海馬組織NSC中ROS水平的高低，為探討肝豆靈對高銅誘導(dǎo)的NSC損傷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機制提供研究基礎(chǔ)。

1?實驗材料

1.1?動物?體重200～220 g SD大鼠75只，SPF級，由安徽動物中心提供，許可證號為SCXK（皖）2014-002。大鼠于專用清潔實驗室飼養(yǎng)1周，溫度25℃，相對濕度50%～70%，模擬自然晝夜循環(huán)光照的非直射光線。孕14d ICR小鼠3只，適應(yīng)性喂養(yǎng)后取胚胎海馬組織，分離并培養(yǎng)NSC。

1.2?分組?SD大鼠隨機分組為對照組，模型組，肝豆靈處理高、中、低劑量組，用藥劑量根據(jù)成人每日使用劑量按照體表面積換算法換算，0.2mL/10g體重灌胃，每日1次。對照組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，兩組均連續(xù)給藥7d。肝豆靈劑量0.0075g/10g體重，每0.3g溶于8mL溶液，低劑量組為0.48g/（kg·d），中劑量組為0.96g/（kg·d），高劑量組為1.92g/（kg·d）。

1.3?實驗材料、儀器與試劑?顯微剪、顯微鑷、45度顯微剪、線栓、普通刀柄、手術(shù)刀片、組織沖洗球，均由上海金粒器械公司提供;空調(diào)，海爾公司;濕度計，上海生工;純水機，Millipore公司;T臂迷宮，友誠生物科技有限公司。胰蛋白酶、DMEM/F12 （1：1）液體培養(yǎng)基，HyClone 公司;胎牛血清、無血清培養(yǎng)添加劑N2，Gibco;重組人表皮生長因子，Peprotech;重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，Peprotech;噻唑藍(lán)，Amresco;二甲基亞砜，Sigma;ROS檢測試劑盒，ThermoScientific;Trizol試劑，Invitrogen;核蛋白提取試劑盒，Sigma公司，DU800紫外可見分光光度計，美國貝克曼;細(xì)胞培養(yǎng)箱2306-2，美國Shellab;倒置顯微鏡DMLL，德國徠卡;Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，美國LI-COR。

1.4?藥物?肝豆靈片。安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制，0.3g/片，150片/盒，批號20150522。由石菖蒲、丹參、姜黃、莪術(shù)、郁金、黃連、大黃、金錢草等組成。

2?實驗方法

2.1?行為學(xué)觀察

2.1.1?原理?在動物心理學(xué)的實驗研究中，迷宮是常用的一種儀器，迷宮任務(wù)具有明顯的空間特征。在記憶類研究中，常用的是放射迷宮。T迷宮是依靠覓食動機誘導(dǎo)動物完成任務(wù)的一種迷宮實驗，實驗操作將大鼠放入迷宮的中央?yún)^(qū)域，然后在每個臂盡頭的小洞放一小塊食物，允許大鼠探究迷宮直到它收集到所有食物。適應(yīng)迷宮后，在兩條目標(biāo)臂中隨機選擇一條臂末端放入食餌，關(guān)閉另一條臂。將動物放入起始箱，使其進(jìn)入目標(biāo)臂獲取食餌，連續(xù)訓(xùn)練一段時間后進(jìn)入正式實驗。先是強迫訓(xùn)練，選擇一條臂開放并放入食餌，另一條臂關(guān)閉，當(dāng)動物進(jìn)入有食餌的臂獲得獎勵后，將其馬上放回主干臂，而后讓其自由探索左右兩臂，動物若進(jìn)入無食餌的臂，記為一次“錯誤次數(shù)”，反之為“正確次數(shù)”，重復(fù)測試多次。統(tǒng)計總的正確率越高，潛伏期越短，表明動物工作記憶越好[7]。完成此任務(wù)大鼠需要依靠參照記憶、工作記憶[8]學(xué)會任務(wù)的規(guī)則。

2.1.2?方法?將大鼠放入起始箱，封閉閘門。打開閘門，大鼠進(jìn)入主干臂，關(guān)掉一側(cè)目標(biāo)臂，強迫大鼠進(jìn)入另一側(cè)開放臂，成功獎勵2粒食丸，5s內(nèi)把大鼠放回主干臂，進(jìn)行二次訓(xùn)練。開放兩個目標(biāo)臂，大鼠把兩前肢和至少兩后肢一只放于一個目標(biāo)臂，則算作完成“一次選擇”。大鼠折返回訓(xùn)練時進(jìn)入過的臂則獲得獎賞4粒食丸，記錄一次正確選擇，進(jìn)入另一臂，沒有獎賞，且將其限制在該臂內(nèi)10s，記錄一次錯誤選擇。訓(xùn)練結(jié)束后，將大鼠放回籠內(nèi)5～10min（同時試驗其他大鼠），重復(fù)訓(xùn)練，每天8次。連續(xù)兩天正確選擇達(dá)15/16，開始試驗。30d后不達(dá)標(biāo)，則淘汰。記錄大鼠進(jìn)入電刺激區(qū)的時間（s）。

2.2?NSC分離、培養(yǎng)，ROS檢測?無菌條件下取孕14d ICR小鼠胚胎海馬組織，以胰蛋白酶解消化，放入含有0.7mg/mL卵蛋白的DMEM/F12（1∶1），機械吹散。在低溫條件下于2000r/min離心細(xì)胞懸液5min，后洗滌沉淀;重懸細(xì)胞，濃度5000～10000/mL，予以懸浮培養(yǎng)。存活細(xì)胞予免疫細(xì)胞化學(xué)檢查，以驗證其是否都為Abcg2+的NSC。體外培養(yǎng)的NSC模型分為對照組、高銅模型組和高、中、低劑量肝豆靈片處理組。對照組在DMEM中加入10%的SD大鼠空白血清，模型組用含10%的SD大鼠空白血清銅負(fù)荷培養(yǎng)基（200μmol/L工作濃度）予以培養(yǎng);肝豆靈低、中、高劑量組予以3種不同劑量配制的10%的肝豆靈藥物血清銅負(fù)荷培養(yǎng)基培養(yǎng)。運用CellROXTM Deep Red Flow Cytometry AssayKit分離、收集、流式分選Agcg2+的NSC。5×105個/mL為各試驗組檢測用細(xì)胞濃度。將CellROX Deep Red reagent（終濃度為500～1000nmol/L）加入至樣本中，于37℃的條件下避光孵育30～60min。于孵育末15min內(nèi)，在每1mL樣本中加1mmol/L SYTOX Blue Dead CellStain solution 1μL，進(jìn)行流式分析。于激發(fā)光波長405nm處檢測SYTOX Blue Dead Cell Stain，于635nm處檢測Cell ROX Deep Red reagent，并分別于450/50BP和665/40BP的濾光片處收集熒光發(fā)射光。

3?統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS22.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（x±s） 表示，組間比較用t檢驗及方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4?結(jié)果

4.1?行為學(xué)結(jié)果?造模前，各組進(jìn)入電刺激區(qū)的時間（s）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療7d后，模型組和小劑量治療組的進(jìn)入電刺激區(qū)的時間（s）明顯增加，經(jīng)過藥物治療后，中、高劑量組進(jìn)入電刺激區(qū)的時間（s）明顯降低。結(jié)果見圖1，表1。

4.2?NSC中ROS水平檢測結(jié)果?模型組高于對照組（P<0.01），肝豆靈組高于對照組（P<0.05），低于模型組（P<0.05）。結(jié)果可見圖2，表2。

5?小結(jié)

WD是基因缺陷引起的銅代謝障礙性疾病，銅離子沉積腦部過多產(chǎn)生神經(jīng)毒性，使神經(jīng)細(xì)胞受損凋亡，發(fā)為WD。銅在腦部沉積以殼核最為顯著[9]。方向等[10]發(fā)現(xiàn)銅負(fù)荷大鼠學(xué)習(xí)定位能力下降，存在明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。韓輝等[5]發(fā)現(xiàn)，高銅可降低小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目。在ATP7B基因缺陷小鼠中，研究人員發(fā)現(xiàn)肝臟和腦部的呼吸鏈復(fù)合物I活性增加，而復(fù)合物II，III和IV活性則減弱。其中，呼吸鏈復(fù)合物I是線粒體產(chǎn)生ROS的主要來源[11]。銅離子促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Altman等[12]證實大腦具有神經(jīng)再生能力，腦組織中存在著的NSC[13]，可很長時間保持靜止?fàn)顟B(tài)，在大腦受到損傷時NSC會大量增生并向受損區(qū)域轉(zhuǎn)移替代，而ROS是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的重要因素[14]。

WD的臨床表現(xiàn)主要有精神障礙、認(rèn)知下降、言語含糊、口涎不止、肝脾腫大、腹部水脹、肢體扭轉(zhuǎn)、震顫等，祖國醫(yī)學(xué)根據(jù)這些癥狀特點將WD歸于“肝風(fēng)”“積聚”“水腫”“痙病”“癲癇”“癡呆”“癲狂”“黃疸”“鼓脹”“癥瘕”“震顫”“瘈疭”等范疇。在發(fā)病機制認(rèn)識方面，中醫(yī)認(rèn)為，肝豆?fàn)詈俗冃韵迪忍旆A賦不足，或先天脾胃失養(yǎng)，或情志所傷，肝郁脾虛，或外感邪毒，銅毒內(nèi)積，濕熱蘊生，痰瘀相結(jié)，癥積成形。楊文明等[15]認(rèn)為“銅毒”是WD發(fā)展過程中獨特的病理基礎(chǔ)，決定其發(fā)展方向。韓輝等[16]研究得出，WD發(fā)病前的證型為肝氣郁結(jié)證、濕熱內(nèi)蘊證、痰瘀互結(jié)證、脾腎陽虛證、肝腎陰虛證。其中認(rèn)知障礙易出現(xiàn)于痰瘀互結(jié)型。我院腦病中心研制的院內(nèi)制劑肝豆靈片，由石菖蒲、郁金、丹參、姜黃、莪術(shù)、雞血藤、黃連、大黃組成。有利膽排銅、清熱解毒、化瘀軟堅之效，石菖蒲開竅豁痰、醒神益智;黃連清熱瀉火解毒;郁金可利膽退黃、清心涼血;大黃，清熱瀉下，解毒利濕;姜黃、莪術(shù)與雞血藤，活血行氣;丹參活血祛瘀、清心除煩。王艷昕等[17]發(fā)現(xiàn)肝豆靈可減少海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦神經(jīng)。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]，保護(hù)腦神經(jīng)。丹參提取物丹參酮ⅡA可減少caspase-3得表達(dá)實現(xiàn)其抗凋亡的機能，而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[19]。大黃可清除離體大鼠腦中的超氧自由基，抑制超氧化物歧化酶的生成，改善學(xué)習(xí)記憶功能。雞血藤可提升腦組織ATP酶活性，改善腦細(xì)胞代謝障礙[20]。黃連可提高機體抗氧化能力[21]，降低ROS，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。郁金、莪術(shù)、姜黃的提取物姜黃素也有抗氧化效應(yīng)[22]。實驗結(jié)果提示，銅負(fù)荷使小鼠NSC中ROS水平明顯上升，大鼠進(jìn)入電刺激區(qū)的時間明顯上升，經(jīng)肝豆靈干預(yù)后，中、高劑量組小鼠NSC中ROS水平明顯下降，大鼠進(jìn)入電刺激區(qū)時間明顯減少?？赏茰y，不同劑量的肝豆靈可通過降低NSC中的ROS水平，對NSC高銅負(fù)荷模型有一定的修復(fù)作用。董婷[4]認(rèn)為，肝豆靈是干擾了NSC中Nrf2的水平，降低了ROS，進(jìn)一步闡述了肝豆靈作用于NSC的作用機制。

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（收稿日期：2019-12-13?編輯：陶希睿）