皮膚惡性黑色素瘤患者Cx43表達(dá)水平及預(yù)后影響因素分析

王峻嶺 李 慧 張冀北 張 麗 劉芳芳

皮膚惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈明顯升高趨勢，年增長率約為3%～5%[1]；手術(shù)切除是其首選的治療方法，但患者術(shù)后生存狀況普遍不樂觀，此病的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明?？p隙連接蛋白(connexin，Cx)是一種跨膜蛋白家族，目前該家族在人類體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)有20余個成員，其中Cx43最常見，并在體內(nèi)廣泛表達(dá)，主要參與細(xì)胞的縫隙連接通訊，近年來發(fā)現(xiàn)其與多個惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。有體外研究[4-5]表明Cx43在皮膚惡性黑色素瘤中可能作為腫瘤抑制因子，過表達(dá)野生型Cx43能明顯增強(qiáng)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的縫隙連接通訊功能，而過表達(dá)突變型Cx43則能減弱該功能，但國內(nèi)尚未見Cx43在皮膚惡性黑色素瘤患者體內(nèi)研究的報(bào)道。本研究檢測56例皮膚惡性黑色素瘤患者的癌組織與癌旁組織Cx43表達(dá)水平，旨在探討影響患者預(yù)后的因素，為臨床預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年12月河北省滄州市中心醫(yī)院收治的56例皮膚惡性黑色素瘤患者為研究對象，其中男35例，女21例，年齡35～75歲，平均(55.75±5.33)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次發(fā)病，入院后均行手術(shù)治療，病理結(jié)果確診為皮膚惡性黑色素瘤；②預(yù)期壽命超過3個月；③術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床及病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>75歲；②合并其他惡性腫瘤或心、肝、肺、腎等臟器嚴(yán)重疾病。

1.2 方法 檢測并比較患者癌組織與癌旁組織的Cx43表達(dá)水平，以全部患者癌組織Cx43表達(dá)水平的中位數(shù)0.85為臨界值，將患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，各28例。收集患者病例資料，比較兩組臨床病理特征和生存狀況，采用多因素Cox回歸模型分析患者預(yù)后的影響因素。

1.2.1 Cx43表達(dá)水平的檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法檢測所有患者癌組織和癌旁組織的Cx43表達(dá)水平：術(shù)中取直徑約10 mm的組織樣本，放至-80℃冰箱保存，采用專門的RNA 提取試劑盒(北京天根生物公司)提取組織的總RNA，全部過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解提取的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)測量RNA的濃度與純度，之后采用專門的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海TaKaRa公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為10 μL，包括模板4 μL、5×Prime Script Buffer 2 μL、DEPC水4 μL，反應(yīng)條件為：37℃ 5 min→85℃ 5 s→4℃ 10 min。然后采用q-PCR檢測Cx43的表達(dá)水平，通過Primer Bank軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物(上海生工生物公司)。Cx43引物序列：上游，5’-TTCAAGCCTACTCAACTGC-3’，下游，5’-CTTCCTTTCGCATCACAT-3’。反應(yīng)體系為20 μL，包括模板4 μL、TB Green Premix Ex TaqⅡ 2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DEPC 水12 μL，反應(yīng)條件為：95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 34 s，循環(huán)40次。以GAPDH表達(dá)水平為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct法[6]計(jì)算 Cx43的相對表達(dá)量。

1.2.2 資料收集 收集并記錄全部患者的病例資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、卡氏評分、發(fā)病部位、原發(fā)灶的厚度、有無潰瘍、原發(fā)灶-淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、Clark分級、治療方法等。術(shù)后通過電話、門診進(jìn)行定期隨訪，隨訪截止時(shí)間為2018年12月30日，以患者死亡為隨訪終點(diǎn)，計(jì)算全部患者的總生存時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織Cx43表達(dá)比較 全部患者癌組織Cx43的相對表達(dá)水平為(0.82±0.31)，低于癌旁組織的(1.00±0.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.392，P=0.020)。

2.2 兩組患者臨床病理資料比較 低表達(dá)組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、Clark分級為Ⅴ級的比例高于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組其他病理資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 兩組患者生存情況比較 全部患者共隨訪4～48個月，中位生存時(shí)間25.3個月，1年、3年生存率分別為87.5%、26.8%。低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為17.9個月，低于高表達(dá)組的32.6個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.875，P<0.05)。

圖1 兩組患者生存曲線比較

2.3 多因素Cox回歸模型結(jié)果 以患者的生存狀況(0=存活，1=死亡)為因變量，相關(guān)臨床病理資料為自變量(賦值情況見表2)，采用最優(yōu)回歸方程篩選變量以進(jìn)行Cox回歸，結(jié)果表明，癌組織Cx43低表達(dá)、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)病部位為非肢端是皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見表3。

表1 兩組患者臨床病理資料比較

表2 自變量賦值表

表3 多因素Cox回歸模型結(jié)果

3 討論

Cx43是Cx家族中最常見的成員之一，主要功能是參與細(xì)胞的縫隙連接通訊，從而介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息交流，與乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多個惡性腫瘤關(guān)系密切[7-9]。從結(jié)構(gòu)上說，Cx43蛋白的C端結(jié)構(gòu)域上有多個結(jié)合位點(diǎn)，能與不同的蛋白進(jìn)行相互作用，故功能較為復(fù)雜，甚至具有兩面性，其在多數(shù)惡性腫瘤上作為腫瘤抑制因子，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[10-11]。Ismail 等[12]研究表明結(jié)腸癌的癌組織中Cx43的表達(dá)較癌旁組織顯著下調(diào)，癌細(xì)胞的Cx43表達(dá)水平也明顯降低。Liu等[13]研究表明卵巢癌組織中Cx43的陽性表達(dá)率顯著低于正常卵巢組織，且過表達(dá)Cx4能減少SKOV3(一種卵巢癌細(xì)胞系)的增殖能力與腫瘤形成。但是，近年來有發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)部分腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移。Poyet等[14]研究表明膀胱癌組織中Cx43表達(dá)升高，其認(rèn)為Cx過表達(dá) 能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞之間的縫隙連接活性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展。本研究分析了皮膚惡性黑色素瘤患者癌組織和癌旁組織的Cx43表達(dá)水平，并進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)了影響患者預(yù)后的預(yù)測因素，為臨床預(yù)后評估提供了參考。

本研究結(jié)果顯示，癌組織Cx43的相對表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)，提示Cx43在皮膚惡性黑色素瘤中可能作為腫瘤抑制因子，與既往體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似[4]。李玢等[5]研究構(gòu)建了小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)過表達(dá)野生型與點(diǎn)突變型Cx43的細(xì)胞模型，結(jié)果表明過表達(dá)野生型Cx43能明顯增強(qiáng)的細(xì)胞縫隙連接通訊功能增強(qiáng)，而過表達(dá)突變型Cx43則減弱細(xì)胞縫隙連接通訊功能。本課題組前期研究[15]表明，Cx43的表達(dá)可能與黑色素瘤的侵襲能力與預(yù)后有關(guān)，Cx43 表達(dá)水平越低，腫瘤侵襲能力越強(qiáng)、病情越嚴(yán)重，且患者往往預(yù)后較差。本研究還發(fā)現(xiàn)Cx43低表達(dá)組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、Clark分級為Ⅴ級的比例明顯高于高表達(dá)組(P<0.05)。Clark分級是黑色素瘤細(xì)胞的浸潤程度評分，Ⅴ級代表已浸潤到皮下組織，病情最為嚴(yán)重，提示癌組織Cx43表達(dá)水平與腫瘤的分期、浸潤程度有關(guān)。本研究全部患者中位生存時(shí)間為25.3個月，低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間更低，僅為17.9個月，顯著低于高表達(dá)組的32.6個月(P<0.05)；多因素Cox結(jié)果也證實(shí)癌組織Cx43表達(dá)水平是患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素(P<0.05)，低表達(dá)者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是高表達(dá)者的2.156倍，提示Cx43的表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展程度有關(guān)，可作為一個皮膚惡性黑色素瘤患者預(yù)后的預(yù)測因子，有待進(jìn)一步研究探討其具體機(jī)制。

綜上所述，皮膚惡性黑色素瘤患者的癌組織Cx43表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，癌組織Cx43呈低水平表達(dá)、TNM分期較晚、非肢端發(fā)病是影響患者預(yù)后的預(yù)測因素。本研究亦有不足之處，屬于單中心研究，納入的病例數(shù)較少，下一步將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證結(jié)論。