甘薯新品種莖尖培養(yǎng)及病毒檢測(cè)技術(shù)

許泳清 李華偉 邱永祥 林趙淼 張鴻 李國(guó)良 邱思鑫

摘 要：為了優(yōu)化甘薯莖尖培養(yǎng)方法，獲得甘薯新品種脫毒試管苗。采用正交試驗(yàn)法，研究NAA、GA3和6BA三種因素對(duì)甘薯莖尖分化和植株再生的影響，篩選培養(yǎng)基最佳配方;在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察不同甘薯品種在最佳培養(yǎng)基組合的莖尖分化和植株再生情況;并用RTPCR方法對(duì)成苗的甘薯品種再生株系進(jìn)行病毒?。⊿PFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV）檢測(cè)。結(jié)果表明：各試驗(yàn)因素對(duì)福薯604莖尖分化成苗影響的主次關(guān)系為6BA>NAA>GA3，福薯604莖尖組培成苗的最佳組合為MS培養(yǎng)基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+

GA3 0.1 mg·L-1，其莖尖組培苗萌芽率為93.3%、成苗率達(dá)50.0%。不同甘薯品種在最佳培養(yǎng)基組合條件下的莖尖分化情況表現(xiàn)不同，其中，福菜薯23和福薯116甘薯品種的莖尖分化和植株再生情況最好。不同甘薯品種試管苗經(jīng)RTPCR檢測(cè)，最終獲得福薯8號(hào)、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯16號(hào)、福薯33和福薯113等12份甘薯脫毒試管苗，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：甘薯;莖尖脫毒;RTPCR;病毒檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S531 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2020）12-0052-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.010

Techniques of Stem Tip Culture and Virus Detection of New Sweet Potato Varieties

XU Yongqing， LI Huawei， QIU Yongxiang， LIN Zhaomiao， ZHANG Hong， LI Guoliang， QIU Sixin

（Institute of Crop Sciences， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observation and Experiment

Station of Tubers in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Fujian Engineering Research Center

for Characteristic Dry Crop Variety Breeding， Fuzhou， Fujian 350013， China）

Abstract： In order to optimize the culture method of the stem tips of sweet potato， and obtain the virusfree testtube plantlet of the new sweet potato variety， the effects of NAA， GA3 and

6BA on the differentiation of stem tips and plant regeneration of sweet potato were studied by orthogonal experiment， and then the best formula of the medium was selected. Based on the orthogonal experiment， the differentiation of stem tips and plant regeneration of different sweet potato varieties in the optimal combination of medium were further investigated， and the method of RTPCR was used to detect the virus diseases （SPFMV， SPCSV， SPVG， SPVC and SPLV） in the regenerated lines of sweet potato varieties after they became seedling. The results showed that the effects of various experimental factors on the differentiation of stem tips and plant regeneration of Fushu 604 were ordered as follows： 6BA， NAA and GA3. The optimal medium combination for the stemtip tissue culture seedling of Fushu 604 was MS medium +6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L-1. The germination rate and seedling rate of the stemtip tissue culture seedling were 93.3% and 50.0%， respectively. Different varieties of sweet potato showed different differentiation of stem tips under the optimal medium combination， among which the varieties of Fucaishu 23 and Fushu 116 showed the best differentiation of stem tips and plant regeneration. The testtube plantlets of different varieties of sweet potato were detected by RTPCR， and then 12 virusfree testtube plantlets of sweet potato were obtained， including Fushu No.8， Fushu 34， Fucaishu 22， Fushu 916， Fushu 90， Fucaishu 23， Fushu 116， Fushu 317， Fushu 604， Fushu No.16， Fushu 33 and Fushu 113， which could be used in the actual production.

Key words： Sweet potato; Virusfree stem tip; RTPCR; Virus detection

甘薯Ipomoea batatas L.Lam是我國(guó)第四大糧食作物，據(jù)統(tǒng)計(jì)2017年全國(guó)甘薯種植面積約337.3萬(wàn)hm2[1]。甘薯以其產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性廣等特點(diǎn)在20世紀(jì)60～70年代被廣泛種植，曾作為“救命薯”救活了一代人[2]。福建省作為我國(guó)甘薯的最早引入地，種植甘薯有400多年的歷史。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所薯類課題組從1978年以來(lái)就開(kāi)始進(jìn)行甘薯育種研究工作，先后選育出了福薯87、福薯2號(hào)、福薯7-6、福菜薯18號(hào)等優(yōu)良品種。近年來(lái)，由于全國(guó)各地種苗調(diào)運(yùn)頻繁，造成福建省甘薯病毒病愈發(fā)嚴(yán)重。生產(chǎn)上流行的甘薯病毒病種類主要有SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV等5種[3]，其中由SPCSV和SPFMV協(xié)生共侵染甘薯引起的病害為甘薯病毒病害（sweetpotato virus diseases，SPVD）[4]，SPVD是甘薯上的毀滅性病害，已成為影響甘薯的最重要病毒病之一，甘薯一旦受侵染，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，甚至絕收。目前還沒(méi)有特效藥能夠防治甘薯病毒病，培育抗病品種和種植健康種苗是最根本的途徑，由于缺少?gòu)V譜抗性的種質(zhì)資源加上病毒自身的變異，給抗病品種的選育帶來(lái)困難，所以培育健康種苗顯得尤為重要。目前健康種苗的獲得是通過(guò)莖尖脫毒培養(yǎng)才能獲取脫毒試管苗，莖尖的成苗率和病毒檢測(cè)技術(shù)越顯重要。本試驗(yàn)通過(guò)篩選適宜的莖尖分化培養(yǎng)基，以提高莖尖成苗率，用RTPCR法檢測(cè)試管苗，以期快速獲得甘薯新品種的脫毒試管苗，為生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2018-2019年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所埔垱實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試甘薯品種材料為福薯604、福薯90、福薯8號(hào)、福薯317、福菜薯23號(hào)、福菜薯22號(hào)等14個(gè)甘薯新品種（表1），均是本課題組通過(guò)雜交選育出的新品種。

1.2 不同激素對(duì)誘導(dǎo)甘薯莖尖分化和成苗的影響

莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用三因素四水平L16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2），以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NAA、6BA、GA3為試驗(yàn)因素，代號(hào)分別為A、B、C，各因素取4個(gè)水平，蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，分裝于21 mm×100 mm的試管中，121℃高壓滅菌20 min后備用。

供試品種為福薯604。取大棚生長(zhǎng)健壯的甘薯莖尖或薯塊發(fā)芽的莖尖（約2 cm長(zhǎng)），剪去大葉，用流水沖洗干凈，置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒滅菌。先用75%乙醇消毒20 s，滅菌水沖洗5次，接著用0.1%升汞消毒2～3 min，滅菌水沖洗5次，放置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，備用。在40×解剖鏡下，剝?nèi)バ∪~片，切取帶1～2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)，迅速接種于配置好的試管培養(yǎng)基表面上，每個(gè)處理接30個(gè)莖尖，3次重復(fù)。

培養(yǎng)條件：在光照強(qiáng)度4000 lx，光照時(shí)間16 h·d-1，溫度25℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。其間觀察莖尖分化和植株再生情況，于60 d后統(tǒng)計(jì)成苗率（以形成2片展開(kāi)葉片的植株為標(biāo)準(zhǔn)）。

1.3 不同甘薯品種莖尖分化和植株再生的形成

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加植物生長(zhǎng)激素萘乙酸（NAA，0.1 mg·L-1）、6芐氨基腺嘌呤（6BA，1.2 mg·L-1）、赤霉素（GA3，0.1 mg·L-1，過(guò)濾滅菌后加入），再加入30 g·L-1蔗糖，5 g·L-1瓊脂，分裝于21 mm×100 mm的試管中，121℃高壓滅菌20 min后備用。供試品種見(jiàn)表1，方法同1.2，每個(gè)品種接20個(gè)莖尖。

1.4 新成苗的甘薯試管苗主要病毒病檢測(cè)

1.4.1 病毒檢測(cè)引物 設(shè)計(jì)并合成了甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）、甘薯退綠矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）、甘薯病毒C（SPVC）和甘薯潛隱病毒（SPLV）特異性檢測(cè)引物，引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表3。

1.4.2 RNA提取及cDNA合成 植物RNA及cDNA合成參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.4.3 RTPCR檢測(cè)和PCR產(chǎn)物測(cè)序 PCR反應(yīng)體系25 μL：取cDNA 2 μL，病毒的上、下游引物各0.5 μL，10 Mix μL，用ddH2O補(bǔ)足至總體積25 μL，混勻后離心。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56～58℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;最后 72℃ 延伸10 min，4℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電壓120 V，結(jié)束后將膠放置于凝膠成像儀上觀察拍照。將PCR產(chǎn)物送至福州尚亞生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對(duì)誘導(dǎo)甘薯莖尖分化和成苗的影響

福薯604在不同處理的培養(yǎng)基中莖尖分化情況結(jié)果列于表4。從表4可以看出，6BA是影響成苗率的主要因素（R=19.325），其次是NAA（R=17.375），影響最小的因素是GA3（R=17.250）。根據(jù)各因素在不同水平成苗率的平均值（K1、K2、K3、K4），福薯604莖尖組培的最佳配方是MS+6BA（1.2 mg·L-1）+NAA（0.10 mg·L-1）+GA3（0.10 mg·L-1），萌芽率達(dá)93.3%，成苗率達(dá)50.0%。16個(gè)處理的莖尖組織都有萌動(dòng)，處理13的萌芽率最低，為76.7%，處理2、3、5、6、11的萌芽率最高，達(dá)100.0%;處理12的愈傷組織分化率最高，達(dá)77.8%，處理1、2、3、4、5、9、13的愈傷組織分化率最低，均為0。

2.2 不同甘薯品種莖尖分化和植株再生情況

從表5可以看出，不同甘薯品種在MS培養(yǎng)基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1 mg·L-1培養(yǎng)條件下的莖尖分化情況表現(xiàn)不同。其中，福菜薯23、福薯116和福薯604莖尖分化最好最快，接種后3 d就可以看見(jiàn)生長(zhǎng)點(diǎn)明顯變大變綠，成苗率也高達(dá)25.6%，說(shuō)明該培養(yǎng)基適宜以上3個(gè)甘薯品種的莖尖分化。福薯8號(hào)、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90接種10 d可見(jiàn)莖尖分化，膨大變淡黃色，但是莖尖基部多數(shù)形成淡黃色愈傷，導(dǎo)致成苗速度變慢，多數(shù)莖尖成苗時(shí)間在30 d以上。福薯317、福薯16號(hào)、福薯113、福薯33等品種莖尖分化較差，接種25 d后有些生長(zhǎng)點(diǎn)出現(xiàn)褐化。福薯203和福薯404莖尖分化情況最差，接種后生長(zhǎng)點(diǎn)分化緩慢，隨后變褐色干枯，未形成完整植株的莖尖，成苗率為0。

2.3 試管苗病毒檢測(cè)結(jié)果

以5種病毒的RNA作模板，用篩選出的SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV引物進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，得到特異性條帶（圖1）。利用建立的RTPCR體系對(duì)成苗的甘薯品種再生株系進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示，其中2份樣品中檢測(cè)出SPFMV、SPCSV和SPVG 3種病毒，未檢測(cè)出SPVC和SPLV，結(jié)果獲得12份脫毒甘薯品種試管苗，分別是福薯8號(hào)、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯113、福薯16號(hào)和福薯33。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同基因型甘薯品種在MS培養(yǎng)基+6BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1+GA3 0.1mg·L-1培養(yǎng)條件下的莖尖分化和植株再生情況表現(xiàn)不同，福菜薯23、福薯116和福薯604莖尖分化速度很快，接種3 d后就可以看見(jiàn)生長(zhǎng)點(diǎn)明顯膨大變綠，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后接分化培養(yǎng)基，25 d后開(kāi)始成苗，成苗率可達(dá)25.6%。福薯317、福薯16號(hào)、福薯113、福薯33等品種莖尖分化較慢，接種后慢慢膨大。福薯8號(hào)、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90等品種出現(xiàn)淡黃色愈傷，轉(zhuǎn)接分化培養(yǎng)基后，40 d才開(kāi)始部分成苗，成苗率最高僅為13.8%。福薯203和福薯404分化差，大部分莖尖出現(xiàn)褐化，慢慢變干枯，最后沒(méi)有成苗的莖尖。這與不同品種莖尖內(nèi)源激素種類和濃度有關(guān)，相關(guān)研究表明[5-9]只有通過(guò)添加外源激素，才能打破個(gè)體內(nèi)源激素間的平衡，并且要有適當(dāng)?shù)臐舛扰浔?，才能使甘薯芽的分化和生長(zhǎng)達(dá)到最佳點(diǎn)[10-11]。因此，針對(duì)不同基因型品種，必須篩選出適宜的激素濃度配比，才能提高成苗速度和成苗率。

培育脫毒苗是目前最為有效的防治甘薯病毒病的方法，在脫毒苗培育過(guò)程中需要對(duì)試管苗進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)，因此，建立能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)病毒的PCR方法具有重要意義。本研究通過(guò)RTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，成苗的12份甘薯品種株系的病毒感染率低。其中，僅福薯604的2個(gè)再生株系檢測(cè)出SPFMV、SPCSV和SPVG，其余株系均未檢測(cè)出。本研究獲得12份甘薯新品種的脫毒試管苗，分別為福薯8號(hào)、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯113、福薯16號(hào)和福薯33，可進(jìn)行大量擴(kuò)繁應(yīng)用于生產(chǎn)。

試驗(yàn)中關(guān)于影響甘薯莖尖分化誘導(dǎo)成苗除了本試驗(yàn)中考慮的因素，其他培養(yǎng)因素有待進(jìn)一步研究探討。本研究?jī)H對(duì)誘導(dǎo)成苗的株系進(jìn)行了病毒檢測(cè)，未開(kāi)展對(duì)攜帶病毒植株脫毒效果的研究。下一步將研究如何提高甘薯試管苗脫毒率和再生率。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）