MALDI-TOF MS方法快速鑒定臨床分離的肺炎克雷伯氏菌

姜彥芬，王金鳳，李睿文，孫曉霞，袁萬(wàn)哲，王建昌

（1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北石家莊 050050；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一種重要的條件性致病菌，屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬，分為3個(gè)亞種：肺炎克雷伯氏菌（K.peneumoniae）、臭鼻克雷伯氏菌（K.ozaenae）和鼻硬結(jié)克雷伯氏菌（K.rhinoscleromatis）[1]。肺炎克雷伯氏菌在自然界廣泛存在，可引起人和多種動(dòng)物的肺炎、腹瀉、腦膜炎、腹膜炎，泌尿系統(tǒng)感染及敗血癥等，同時(shí)還可以污染食品，造成食品中毒[2-4]。近年來(lái)，肺炎克雷伯氏菌引起的動(dòng)物疫情不斷增多，已成為危害我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的重要病原之一[5-7]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)生化鑒定方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)生化鑒定方法操作繁瑣、周期較長(zhǎng)，對(duì)技術(shù)人員要求較高，同時(shí)鑒定結(jié)果受細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)、生化試劑質(zhì)量等多個(gè)外部因素影響。近年來(lái)，用于肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)和鑒定的分子生物學(xué)方法較多，主要有16SrRNA測(cè)序、普通PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和重組酶聚合酶擴(kuò)增等方法。這些方法對(duì)于該菌引起的動(dòng)物疫情防控和食品污染控制發(fā)揮了重要作用[4，8-10]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是 近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型微生物快速鑒定技術(shù)，也是近年來(lái)臨床微生物鑒定領(lǐng)域最具代表性的技術(shù)之一。其基本原理是，將樣品與基質(zhì)在靶板上形成共晶體，基質(zhì)從激光中吸收能量使樣品解吸附，基質(zhì)與樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，使樣品分子電離，經(jīng)過(guò)飛行時(shí)間檢測(cè)器后，將不同質(zhì)荷比（m/z）的離子分開(kāi)，形成特異性肽/蛋白質(zhì)指紋圖譜[11]。每種微生物都有其自身獨(dú)特的肽/蛋白質(zhì)組成。MALDITOF MS主要通過(guò)分析待測(cè)微生物的特征蛋白指紋圖譜，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株特征蛋白指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而實(shí)現(xiàn)微生物的快速鑒定[11]。同傳統(tǒng)微生物生理生化鑒定方法相比，MALDI-TOF-MS方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、高通量和成本低等優(yōu)點(diǎn)[12]。目前MALDI-TOF MS已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌、醫(yī)學(xué)臨床微生物和獸醫(yī)臨床微生物的快速鑒定。本研究對(duì)從體溫升高、嚴(yán)重呼吸道癥狀并死亡的綿羊肺臟中分離到1株病原菌，通過(guò)MALDI-TOF MS方法將其快速鑒定為肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

血瓊脂平板培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；甲酸（Formic acid，F(xiàn)A）、三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）、乙 腈（Acetonitrile，ACN）、無(wú)水乙醇，均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）和細(xì)菌實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品（bacterial test standard，BTS），購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；VITEK2陰性菌鑒定卡（GN），購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；T-Vecter pMD19（Simple），購(gòu)自寶生物生物工程（大連）有限公司；GoTaq?Green Master Mix 2×、Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System，購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Autoflex speed TOF/TOF），德國(guó)布魯克公司生產(chǎn)；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK2（compact），法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)；PCR擴(kuò)增儀（Bio-rad，C1000型），美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 采集發(fā)病死亡羊的肺臟，用接種環(huán)劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況；挑取典型菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h以獲得單菌落；挑取純培養(yǎng)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)，并進(jìn)行后續(xù)菌種鑒定。

1.2.2 MALDI-TOF MS鑒定

1.2.2.1 溶液配制 按乙腈:三氟乙酸:無(wú)菌去離子水體積比50:2.5:47.5的比例配制基質(zhì)溶劑；按照試劑配制說(shuō)明，使用基質(zhì)溶劑配制CHCA基質(zhì)溶液和BTS標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 樣品前處理和點(diǎn)樣 使用甲酸提取法進(jìn)行待測(cè)細(xì)菌蛋白前處理。取TSA平板上3～5個(gè)細(xì)菌單克隆，重懸于300 μL去離子水中，混勻；加入900 μL無(wú)水乙醇，充分混勻，12 000×g離心2 min；棄上清液后繼續(xù)12 000×g離心1 min；吸棄上清液，室溫放置5 min干燥沉淀，然后加入50 μL 70%甲酸溶液，充分重懸細(xì)菌沉淀，再加入等體積乙腈；充分混勻后12 000×g離心2 min；取1 μL上清液點(diǎn)加到MALDI-TOF MS靶板上，待自然干燥后，在靶點(diǎn)上加1 μL CHCA基質(zhì)溶液均勻覆蓋；同時(shí)在靶板另一位置點(diǎn)加1 μL BTS標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于儀器校正，待自然干燥后，在靶點(diǎn)上加1 μL CHCA基質(zhì)溶液均勻覆蓋；自然干燥后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)采集和結(jié)果鑒定 使用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)質(zhì)譜儀校準(zhǔn)后進(jìn)行樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和分析。運(yùn)用FlexControl 軟件采集樣品數(shù)據(jù)，選擇線性操作模式和正離子模式。應(yīng)用BioTyper 軟件將采集樣品圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)匹配度得分判定結(jié)果：分值為2.300～3.000，標(biāo)記為（+++），表示菌種鑒定可信度較高，可完全確認(rèn)菌株鑒定結(jié)果；2.000～2.299，標(biāo)記為（++），表示可信的菌屬鑒定和可能的菌種鑒定，可基本確認(rèn)菌株鑒定結(jié)果；1.700～1.999，標(biāo)記為（+），表示可能菌屬鑒定，菌株鑒定為不確定結(jié)果；0～1.699，標(biāo)記為（-），表示鑒定結(jié)果不可信。

1.2.3 VITEK2鑒定 挑取TSA平板上純培養(yǎng)24 h后的細(xì)菌，使用3 mL 0.45% NaCl溶液制備菌懸液；使用比濁儀測(cè)定濁度，調(diào)節(jié)菌懸液在0.50～0.63麥?zhǔn)蠞岫葐挝恢g；使用VITEK 2陰性菌鑒定卡，通過(guò)VITEK2 compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行分離菌鑒定。

1.2.4 16SrRNA測(cè)序鑒定 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取TSA平板上分純細(xì)菌的基因組DNA，并以之為模板進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA基因擴(kuò)增，大小約為1 500 bp。PCR上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游引物1492R 5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系為：GoTaq? Green Master Mix（2×）12.5 μL，27F/1492R（20 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。回收PCR產(chǎn)物并連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用 Blast 程序?qū)y(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

培養(yǎng)24 h后，血平板上可見(jiàn)圓形、邊緣整齊、不透明、灰白色菌落，粘稠，接種環(huán)挑取菌落時(shí)易拉起長(zhǎng)絲，呈現(xiàn)β溶血。鏡檢為革蘭氏陰性，單個(gè)或成對(duì)存在，為粗短狀桿菌。

2.2 MALDI-TOF MS鑒定

通過(guò)MALDI-TOF-MS檢測(cè)及BioTyper軟件分析，以檢測(cè)到的離子峰強(qiáng)度（intens）為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比（m/z）為橫坐標(biāo)，獲得的分離菌蛋白指紋圖譜基線平穩(wěn)、蛋白峰多、結(jié)果良好，離子峰在5 371.5m/z左右出現(xiàn)的強(qiáng)度最高。分離菌蛋白指紋圖譜具體如圖1所示。通過(guò)與Bruker數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，分離菌被鑒定為“肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種”，匹配分值為2.549，標(biāo)記為（+++），表示菌種鑒定可信度高，可完全確認(rèn)菌株鑒定結(jié)果，并達(dá)到了亞種水平的鑒定。數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果如圖2所示。

2.3 VITEK2鑒定

根據(jù)分離菌株的48項(xiàng)生化反應(yīng)結(jié)果，分離菌鑒定為肺炎克雷伯氏菌。

圖1 分離菌株MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)指紋圖譜

圖2 分離菌株蛋白指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)結(jié)果

2.4 16SrRNA鑒定

以分離菌株基因組DNA作為模板，經(jīng)PCR后可擴(kuò)增出大小約為1 500 bp的目的片段。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與數(shù)據(jù)庫(kù)中肺炎克雷伯氏菌的序列同源性在99.4%以上，由此鑒定為肺炎克雷伯氏菌。

3 討論

本研究基于MALDI-TOF MS方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床分離肺炎克雷伯氏菌的快速鑒定，這對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)中逐年增多的肺炎克雷伯氏菌感染的防控具有重要意義。本研究中，從獲得純菌落到出鑒定結(jié)果，MALDI-TOF MS方法需要約30 min，VITEK2方法需要4 h左右，而16SrRNA測(cè)序方法需要對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，至少需要2個(gè)工作日才能得到測(cè)序和鑒定結(jié)果。同時(shí)，MALDI-TOF MS方法直接將臨床分離肺炎克雷伯氏菌鑒定到亞種水平。

目前MALDI-TOF MS方法在布魯氏菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、愛(ài)德華氏菌、假絲酵母菌等不同種類微生物快速鑒定中得到了廣泛應(yīng)用[13-17]。同傳統(tǒng)生化方法和分子生物學(xué)方法相比，MALDITOF MS方法操作簡(jiǎn)單、成本低、鑒定速度快、檢測(cè)通量大，還具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性[18]。使用MALDI-TOF MS方法進(jìn)行微生物鑒定，樣品前處理較為簡(jiǎn)單，用甲酸提取法即可實(shí)現(xiàn)對(duì)絕大部分微生物的有效鑒定，同時(shí)在處理前無(wú)需革蘭氏染色確定待鑒定微生物為革蘭氏陰性或陽(yáng)性。MALDITOF MS鑒定過(guò)程中，耗材成本低，無(wú)需特殊試劑，僅需少量基質(zhì)（1 μL）；1塊靶板1次可實(shí)現(xiàn)384株待測(cè)菌的高通量檢測(cè)，靶板清洗后還可以重復(fù)使用；檢測(cè)時(shí)間短，上機(jī)后僅需約30 s即可實(shí)現(xiàn)對(duì)1株待測(cè)菌的有效鑒定。梁達(dá)煒等[14]研究表明，MALDI-TOF MS方法鑒定沙門(mén)氏菌的耗材成本約為VITEK2的1/3，檢測(cè)時(shí)間約為VITEK2的1/2。汪琦等[15]研究表明，MALDI-TOF MS方法對(duì)1株細(xì)菌的檢測(cè)成本約為1～2元，能夠在30 min內(nèi)獲得鑒定結(jié)果，而VITEK2則需要約30～40元，大約需要8 h。在檢測(cè)時(shí)間和成本方面，本研究對(duì)肺炎克雷伯氏菌的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果和前述研究基本一致。MALDI-TOF MS方法對(duì)微生物的鑒定是基于對(duì)微生物胞內(nèi)固定表達(dá)的高豐度核糖體蛋白的檢測(cè)和分析，理論上不同的培養(yǎng)條件不會(huì)導(dǎo)致MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果有明顯差異[18]。目前MALDI-TOF MS方法的局限性主要有兩點(diǎn)：一是質(zhì)譜儀設(shè)備成本高，難以在基層實(shí)驗(yàn)室普及；二是微生物數(shù)據(jù)庫(kù)的完整程度和質(zhì)量存在不足，導(dǎo)致一部分微生物無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定，如難以區(qū)分大腸埃希氏菌和志賀氏菌屬，無(wú)法有效區(qū)分蠟樣芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌等[18]。隨著MALDI-TOF MS方法的進(jìn)一步普及和數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，上述不足有希望得到有效完善。

作為一種新型微生物鑒定技術(shù)，MALDI-TOF MS方法可以作為肺炎克雷伯氏菌日常檢測(cè)的有效工具，同時(shí)還可以基于質(zhì)譜儀自建數(shù)據(jù)庫(kù)功能，對(duì)某地區(qū)或農(nóng)場(chǎng)所分離的肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行聚類分析和分型，分析菌株之間的親緣關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)新分離肺炎克雷伯氏菌的快速準(zhǔn)確鑒定和有效溯源。