雙孢菇酪氨酸酶的提取純化及其性質(zhì)

閔玉濤，宋彥顯*，馬慶一

1. 鄭州工程技術(shù)學(xué)院（鄭州 450044）；2. 鄭州輕工業(yè)學(xué)院（鄭州 450002）

雙孢菇（Agaricus bisporus）是全球種植范圍最廣、產(chǎn)量最大的一種食用菌，中國(guó)各地均有種植，是中國(guó)出口量最大的蘑菇[1]。雙孢菇營(yíng)養(yǎng)豐富，含有8種人體必需氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、核苷酸等物質(zhì)[2-3]，具有抗氧化、抗衰老、抑菌、降血糖、預(yù)防肥胖、消炎、抗癌等保健作用[4-7]，口味鮮美，深受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)空間較大。雙孢菇成熟后，水分在90%以上，多酚物質(zhì)含量多，質(zhì)地鮮嫩，生理代謝旺盛，在貯運(yùn)、售賣過程中易褐變，若受機(jī)械損傷，褐變加劇，致保鮮期非常短[8]。因此，雙孢菇的采后保鮮一直是研究的熱點(diǎn)之一[9-12]。

酪氨酸酶（TYR）又稱兒茶酚氧化酶、多酚氧化酶等[13]，以酚類及其衍生物、羧酸及其衍生物等為底物[14]，是雙孢菇酶促褐變的關(guān)鍵酶。雙孢菇中酪氨酸酶可以催化酪氨酸等底物形成二羥苯丙氨酸（多巴），多巴是一種輔助底物，被酪氨酸酶催化形成多巴醌，轉(zhuǎn)化形成黑色素，從而導(dǎo)致褐變。因此，一切可降低或抑制雙孢菇酪氨酸酶的條件均可減少黑色素的形成，防止雙孢菇酶促褐變。

試驗(yàn)采用丙酮沉淀，硫酸銨鹽溶鹽析和透析、反滲透相結(jié)合的方法提取雙孢菇中的酪氨酸酶并部分純化，研究酶學(xué)性質(zhì)，為雙孢菇采后保鮮、防止褐變、延長(zhǎng)貨架期提供依據(jù)，同時(shí)為美白和烏發(fā)化妝品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢菇（鄭州毛莊菜市場(chǎng)）。丙酮（AR級(jí)，安徽宿州化學(xué)試劑廠）；硫酸銨（AR級(jí)，新鄉(xiāng)市化學(xué)試劑廠）；氟化鈉（AR級(jí)，萊陽(yáng)化工實(shí)驗(yàn)廠）；磷酸氫二鈉（AR級(jí)，北京紅星化工廠）；磷酸二氫鉀（AR級(jí)，萊陽(yáng)化工實(shí)驗(yàn)廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（SP-2102 PC型，上海光譜儀器有限公司）；三用紫外分析儀ZF-C型（上?？岛坦怆妰x器有限公司）；高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL-18 C型，上海安亨科學(xué)儀器廠）；離心沉淀器（80-1型，上海手術(shù)器械廠）；組織勻漿機(jī)（JJ-2型，金壇市億通電子有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（GL型，湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酪氨酸酶的提取與純化

雙孢菇清洗，去水，切塊，按照1︰1比例加入pH 6.8磷酸緩沖液，組織勻漿至漿狀，4 ℃，5 000 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液即為粗酪氨酸酶液。粗酶液加等體積丙酮沉淀，同上述條件離心，棄上清，加10%飽和(NH4)2SO4溶解沉淀，同條件離心，上清液即為初步純化酪氨酸酶液。將初步純化酪氨酸酶液調(diào)整(NH4)2SO4飽和度至60%，靜止沉淀，同條件離心，用pH 6.8的磷酸緩沖液溶解沉淀，半透膜透析、反滲透，制備酪氨酸酶液。分別測(cè)定粗酶液、初步純化酶液、純化后酶液酶活力和蛋白含量。

1.3.2 酪氨酸酶活力的測(cè)定

參照馬慶一等[15]的方法，于波長(zhǎng)317 nm處比色法測(cè)定酶活力。反應(yīng)體系為2.5 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的pH 6.8磷酸鹽緩沖液，于室溫（20 ℃左右）中加入0.02 mL純化后酶液，迅速混勻，使用紫外可見分光光度計(jì)，于波長(zhǎng)317 nm處比色。酶液加入后開始計(jì)時(shí)，每30 s記錄1次吸光度隨時(shí)間的變化值，以最初的直線部分計(jì)算反應(yīng)速率。定義吸光度每分鐘增加0.001為1個(gè)酶活力單位。

1.3.3 酪氨酸酶性質(zhì)的研究

1) 底物濃度與酶活性的影響

測(cè)定不同底物濃度下反應(yīng)速度隨時(shí)間的變化。分別取2.0，1.5，1.0，0.8，0.5和0.1 mL含2 mmol/L L-酪氨酸（底物）的pH 6.8磷酸鹽緩沖液，加pH 6.8的磷酸緩沖液使總體積均為4 mL，加入0.02 mL酪氨酸酶液，按1.3.2小節(jié)在317 nm比色測(cè)定酶活力。

2) pH對(duì)酶活性的影響

分別取4 mL pH 3～8.5 10種pH的磷酸鹽緩沖液（含1 mmol/L L-酪氨酸），25 ℃保溫10 min后，立即加入0.02 mL酪氨酸酶液，按1.3.2小節(jié)在317 nm比色測(cè)定酪氨酸酶的活性。

3) 溫度對(duì)酶活性的影響

反應(yīng)體系為4 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的pH 6.8磷酸鹽緩沖液，在5～60 ℃不同溫度的水浴中保溫10 min后，立即加入0.02 mL純化后酶液，混勻后按1.3.2小節(jié)在317 nm測(cè)定酪氨酸酶活性。

4) 異VC鈉對(duì)酶活性的影響

以4 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的pH 6.8磷酸鹽緩沖液為底物，分別測(cè)定無抑制劑、加入0.01%異VC鈉時(shí)酶反應(yīng)速度隨時(shí)間的變化，繪制酶反應(yīng)速度曲線，比較抑制劑對(duì)酶活性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪氨酸酶的提取

緩沖溶液粗提應(yīng)在0～4 ℃下進(jìn)行，以防止酪氨酸酶失活，緩沖溶液中加入0.1 mol/L NaF，以抑制提取過程中酶促反應(yīng)的進(jìn)行，防止褐變的發(fā)生，避免酶失活。采用丙酮沉淀酪氨酸酶，整個(gè)操作過程控制在0～4 ℃下進(jìn)行。

2.2 酪氨酸酶的比活力及純化倍數(shù)的測(cè)定

粗酶、初步純化酶液和純化后酪氨酸酶的酶活力、蛋白含量、比活力和純化倍數(shù)如表1所示。

結(jié)果表明，在提純過程中，第一步經(jīng)過丙酮沉淀和硫酸銨鹽溶，酶活提高5倍，而蛋白質(zhì)含量卻下降近1/2。第二步經(jīng)過60%飽和硫酸銨鹽析，在蛋白質(zhì)含量沒有明顯提高情況下，酶活提高近70倍，比酶活提高500余倍，說明經(jīng)過丙酮沉淀和硫酸銨鹽溶，去除部分雜蛋白。試驗(yàn)中鹽溶用10%飽和硫酸銨溶液，鹽析中硫酸銨用量60%的飽和度，結(jié)果證明這樣可有效去除雜蛋白，純化效果明顯。

表1 酪氨酸酶純化過程中的酶活力、蛋白含量、比活力和純化倍數(shù)

2.3 酪氨酸酶的性質(zhì)

2.3.1 底物濃度與酶活性的關(guān)系

根據(jù)酶活隨底物濃度的變化值，繪制出不同底物濃度酶反應(yīng)速度曲線，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果表明，底物與酶活呈典型的矩形雙曲線，當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?.4 mmol/L時(shí)，為一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速率和底物濃度呈正比；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.804 mmol/L時(shí)，反應(yīng)速率趨近最大反應(yīng)速率，接近零級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速率不再隨著底物濃度增加而增加。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏動(dòng)力學(xué)方程。

圖1 底物濃度與酶活的關(guān)系

2.3.2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程

采用雙倒數(shù)作圖法，以1/[s]為橫坐標(biāo)，以1/V縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖2所示。

由圖2得出的線性方程y=0.013 1x+0.024 1可知，直線在y軸上的截距為1/Vmax=0.024 1，則Vmax=41.5 U/min，在x軸上的截距為-1/Km=-1.840，則Km=0.543 mmol/L。

圖2 作圖法求Vmax和Km

2.3.3 pH對(duì)酶活力的影響

在不同pH條件下，在317 nm處吸光度隨時(shí)間變化結(jié)果，以pH為橫坐標(biāo)，不同pH時(shí)的酶活為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖3。

酪氨酸酶的最適pH為6.5，其在pH 6.5附近保持較高的活性，在pH 6.5以下酶活力與pH呈正相關(guān)關(guān)系；在pH 6.5時(shí)達(dá)到最大值；大于pH 6.5時(shí)，酶活力與pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖3 pH對(duì)酶活的影響

2.3.4 溫度與酶活的關(guān)系

不同溫度時(shí)，在317 nm處吸光度隨時(shí)間變化結(jié)果，以溫度為橫坐標(biāo)，不同溫度時(shí)的酶活為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖4。

酪氨酸酶最適溫度為30 ℃，其在30 ℃左右保持較高酶活力，溫度對(duì)酶活的影響呈“鐘罩形”曲線。

圖4 溫度對(duì)酶活的影響

2.3.5 異VC對(duì)酶活性的影響

異VC及對(duì)照在317 nm處吸光度隨時(shí)間變化結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同時(shí)間的吸光度為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖5。

異VC鈉是常用抗褐變劑，它能有效地抑制酪氨酸酶活性，使反應(yīng)速度減慢，是酪氨酸酶的抑制劑之一。

圖5 抑制劑對(duì)酶活的影響

3 結(jié)論

經(jīng)過丙酮沉淀和硫酸銨鹽溶、鹽析、透析和反滲透等方法提取純化后，酶活力為1 710 U/mL，比活力為357.89 U/mg蛋白，純化倍數(shù)為501.2。L-酪氨酸為底物，雙孢菇中酪氨酸酶的Km=0.543 mmol/L，Vmax=41.5 U/min。在pH 5～7之間酶活較高，最適pH為6.5；最適反應(yīng)溫度為30 ℃，異VC能有效抑制酪氨酸酶活性，反應(yīng)速度與酶量、底物濃度關(guān)系均符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。