果香風(fēng)味導(dǎo)向白地霉M5的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

賈麗艷 田宇敏 荊 旭 郭晉田 王曉勇 王慶亮 韓 英

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心 山西太谷030801 3 山西杏花村汾酒廠股份有限公司 山西汾陽032209）

風(fēng)味導(dǎo)向技術(shù)是采用現(xiàn)代風(fēng)味化學(xué)及分析化學(xué)理論，從白酒的微量成分中發(fā)現(xiàn)和確定對(duì)白酒具有風(fēng)味貢獻(xiàn)度的風(fēng)味化合物。通過風(fēng)味化合物的指向，形成功能微生物篩選技術(shù)、風(fēng)味化合物發(fā)酵調(diào)控技術(shù)、風(fēng)味優(yōu)化重組技術(shù)，可促進(jìn)中國(guó)白酒釀造理論、品質(zhì)及技術(shù)升級(jí)[1]。

中國(guó)白酒是世界六大蒸餾酒之一，由于地理環(huán)境、原料及工藝的不同，中國(guó)不同地域的白酒具有不同的風(fēng)格。白酒由98%～99%的酒精和水及1%～2%的風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成[2]。白酒風(fēng)格的不同主要是由風(fēng)味物質(zhì)組成及含量的不同所致。清香型白酒是中國(guó)白酒主要的一支，而汾酒又是清香型白酒的典范，其采用傳統(tǒng)釀造技藝，以高粱、豌豆、大麥為原料，通過網(wǎng)絡(luò)區(qū)域環(huán)境中獨(dú)特的微生物，采用固態(tài)地缸發(fā)酵，清蒸二次清工藝，甑桶蒸餾而成，其獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)組成賦予了汾酒清香醇正的風(fēng)格[3]。徐巖等[1]利用GC-O 技術(shù)，從汾酒中共檢測(cè)到香氣組分100 個(gè)，包括辛酸乙酯、β-DMST、己酸乙酯、乙縮醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯、β-苯乙醇等酸類、醛類、醇類、酯類、酚類、吡嗪類、呋喃類、萜烯類等物質(zhì)。汾酒酒醅是一個(gè)天然優(yōu)質(zhì)的微生物菌種資源庫(kù)。依據(jù)風(fēng)味導(dǎo)向技術(shù)，從酒醅中分離篩選產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)菌株，對(duì)于中國(guó)白酒的純種發(fā)酵、強(qiáng)化發(fā)酵或定向發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的意義。

本研究利用國(guó)家級(jí)白酒品酒師的嗅聞技術(shù)和HS-SPME-GC-MS 檢測(cè)技術(shù)，從汾酒酒醅中分離篩選產(chǎn)果香風(fēng)味酵母。通過菌落及菌體形態(tài)觀察、生理生化特征及26S rDNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析技術(shù)鑒定產(chǎn)香菌株，研究其生物學(xué)特性，為該菌株在中國(guó)白酒及其它釀造類食品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為清香型白酒的純種發(fā)酵或強(qiáng)化發(fā)酵提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品

山西杏花村某酒廠新鮮發(fā)酵酒醅。

1.2 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基：孟加拉紅選擇培養(yǎng)基，購(gòu)自北京路橋公司。

YEPD 培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，蒸餾水100 mL，pH 5.0～5.5、121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min[4]。

麥芽汁培養(yǎng)基：將8 g 麥芽汁浸提膏溶解于100 mL 水中，121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min。

發(fā)酵用培養(yǎng)基：包括液態(tài)發(fā)酵用培養(yǎng)基（YEPD 培養(yǎng)基）和4 種固態(tài)發(fā)酵用培養(yǎng)基，分別為（1）麩皮和高粱組合培養(yǎng)基：15 g 麩皮、15 g 粉碎高粱和30 mL 水；（2）稻殼與高粱組合培養(yǎng)基：15 g 粉碎高粱、7.5 g 稻殼和12.5 mL 水；（3）高粱培養(yǎng)基：15 g 粉碎高粱和15 mL 水；（4）糖化酶與高粱組合培養(yǎng)基：15 g 紅糝、0.06 g 糖化酶和12 mL 水。以上培養(yǎng)基混勻后，121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離 取新鮮酒醅10 g，放入無菌生理鹽水中，混勻，28 ℃，靜置30 min，10 倍倍比稀釋至10-5。分別取100 μL 倍比稀釋液涂布于孟加拉紅選擇培養(yǎng)基上，靜置20 min 后，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，選擇酵母菌菌落特征明顯的單菌落，進(jìn)一步劃線2～3 次，獲得純菌落。將純化的疑似酵母菌落轉(zhuǎn)入YEPD 固體斜面，4 ℃保存，備用。

1.3.2 酵母的篩選 將酵母菌株接種于YEPD 和麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。3 名國(guó)家級(jí)白酒品酒師對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行聞香，并記錄聞香結(jié)果。

1.3.3 香氣物質(zhì)的測(cè)定 將10%產(chǎn)香酵母接種于發(fā)酵用培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)24 h，以未接菌的培養(yǎng)基原料作為對(duì)照，通過嗅覺聞香及HSSPME-GC-MS 技術(shù)檢測(cè)不同培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)香能力的影響。

1.3.4 HS-SPME-GC-MS 條件 GC 條件：TG-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫采用程序升溫，起始溫度50 ℃，保留時(shí)間2 min，以5℃/min 升至240 ℃，保留5 min；進(jìn)樣口溫度為240℃，載氣為He 流速1.0 mL/min，氦氣流速：1 mL/min；柱前壓57.4 kPa，分流比10∶1。MS 條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，連接桿溫度230 ℃，掃描范圍：33～450 amu。數(shù)據(jù)檢索：通過計(jì)算機(jī)對(duì)檢出的各組分進(jìn)行檢索，以Willey和NIST 為檢索譜庫(kù)[5-7]。

1.3.5 產(chǎn)酯能力的測(cè)定 以10%的接種量將活化好的菌株分別接種于發(fā)酵用培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 d 測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基的總酯含量[8]。

1.3.6 菌株的鑒定

1.3.6.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察及理化特性分析 參照文獻(xiàn)[9-12]做菌落、菌體形態(tài)觀察與生理生化分析。

1.3.6.2 菌株26S rDNA 的PCR 擴(kuò)增及序列的測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析 酵母菌 26S rDNA D1D2區(qū)域序列擴(kuò)增引物為 NL1 （5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3'）和NL4（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3'），購(gòu)自上海生工公司。序列的測(cè)定由上海生工完成。登陸http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank，對(duì)待測(cè)菌株26s r DNA 序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)；選取數(shù)據(jù)庫(kù)中有代表性的菌株26S rDNA，采用clustalx 1.83 軟件的Multiple Sequence Alignment 程序進(jìn)行同源性序列比對(duì)；采用MEGA5.1 軟件，以鄰接法（Neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap=1 000）[13]。

1.3.7 產(chǎn)香菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將活化的菌株接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，以3.0%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min 培養(yǎng)，每隔3 h 取樣，測(cè)定OD600值。以未接種麥芽汁培養(yǎng)基作空白對(duì)照，重復(fù)試驗(yàn)3 次，求其平均值，繪制生長(zhǎng)曲線[14]。

1.3.8 酸堿耐受性的測(cè)定 用1 mol/L HCl 溶液分別調(diào)節(jié)YEPD 培養(yǎng)液pH 為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，滅菌后，以3.0%的接種量接入菌株M5，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h 后，測(cè)定OD600值，考察其耐酸堿能力。試驗(yàn)重復(fù)3 次，以未接種YEPD 培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.9 糖耐受性的測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株分別以3.0%的接種量接種于含有50，100，150，200，250，300，350，400 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度的YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值。試驗(yàn)重復(fù)3 次，以未接種YEPD 培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.10 酒精耐受性的測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株分別以3%的接種量接種于含有體積分?jǐn)?shù)分別為3%，6%，9%，12%，15%，18%，21%酒精的YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min 培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600值。試驗(yàn)重復(fù)3 次，以未接種YEPD 培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.11 溫度耐受性的測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株分別以3.0%的接種量接種于YEPD 液體培養(yǎng)基中，分別置于28，30，35，40，45，50 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm值。試驗(yàn)重復(fù)3 次，以未接種YEPD 培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.12 總酯含量的測(cè)定 采用堿皂化法，按GB/T19777-2013 規(guī)定的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香菌的初篩

經(jīng)富集培養(yǎng)，平板涂布，劃線分離和對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的嗅聞，從清香型白酒酒醅樣品中分離、篩選菌株，獲得1 株產(chǎn)清新果香味的菌株M5。

2.2 菌株M5 發(fā)酵香氣感官評(píng)價(jià)

微生物的風(fēng)味代謝產(chǎn)物的種類不僅與菌體有關(guān)，而且也受發(fā)酵用原料的影響[15]。為此，將菌株M5 接種于4 組不同的固體培養(yǎng)基和1 組YEPD液體培養(yǎng)基中，分別編號(hào)為空白對(duì)照，1，2，3，4，5。置于28 ℃培養(yǎng)24 h 后，國(guó)家級(jí)品酒師對(duì)發(fā)酵后的培養(yǎng)基進(jìn)行聞香試驗(yàn)。結(jié)果見表1。聞香評(píng)價(jià)結(jié)果表明添加糖化酶高粱培養(yǎng)基的產(chǎn)香效果最好，第4 組的原料產(chǎn)香效果最好；YEPD 液體培養(yǎng)發(fā)酵液香氣次之。

表1 聞香試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of smelling test

2.3 產(chǎn)香菌香氣成分測(cè)定結(jié)果

以未發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，采用HS-SPMEGC-MS 聯(lián)用法測(cè)定香氣佳的組4 和組5 揮發(fā)性香氣成分，色譜圖見圖1，通過峰面積歸一化法計(jì)算出各樣品中風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量，并根據(jù)風(fēng)味物質(zhì)的類別分類，結(jié)果成分分析見表2。

菌株的生長(zhǎng)、代謝受環(huán)境條件的影響較大。不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)條件可能會(huì)影響產(chǎn)香菌株產(chǎn)生香氣成分的不同。對(duì)菌株M5 在YEPE 培養(yǎng)基和糖化酶與高粱組合發(fā)酵培養(yǎng)基及未發(fā)酵培養(yǎng)基里的主體風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定，共檢測(cè)出香氣成分151種，其中醇類22 種，酯類47 種，酸類17 種，醛類12 種，酮類8 種，酚類8 種，烷烴類23 種，烯烴類2 種，雜環(huán)類11 種，表4為主要香氣成分分析結(jié)果。

未經(jīng)發(fā)酵的糖化酶與高粱組合培養(yǎng)基本身香氣成分共分離出70 種化學(xué)成分，經(jīng)鑒定得59 種化合物，分別為：醇類18 種，占總揮發(fā)性香氣成分的48.2%；酯類4 種（0.44%）；酸類7 種（12.29%）；酚類6 種（34.16%）；醛類、酮類、烷烴類、烯烴類和雜環(huán)類共22 種，占總揮發(fā)性香氣成分的4.33%。固態(tài)培養(yǎng)基原有香氣成分主要是醇類和酚類，以（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇和4-乙基愈創(chuàng)木酚為主，4-乙基愈創(chuàng)木酚具有木香和香莢蘭的隱香。

圖1 菌株M5 發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分GC-MS 總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram on volatile aroma components of M5 in different fermented broth by GC-MS

菌株M5 發(fā)酵糖化酶與高粱組合培養(yǎng)基中揮發(fā)性成分經(jīng)檢測(cè)，鑒定出67 種化合物，其中醇類7 種，占總體揮發(fā)性香氣成分的35.43%；酯類36種，占總體揮發(fā)性香氣成分的51.32%；酸類、醛類、酮類、酚類、烷烴類和雜環(huán)類共25 種，總計(jì)香氣揮發(fā)成分含量為12.4%。與對(duì)照相比，β-苯乙醇和異戊醇等高級(jí)醇是其主要的揮發(fā)性香氣成分，也是酒精發(fā)酵所得副產(chǎn)物，這些化合物是由酵母在相應(yīng)的氨基酸分解代謝下形成，或由葡萄糖代謝途徑形成[16]。β-苯乙醇香氣具有清甜玫瑰花香、茉莉和紫羅蘭香氣，占總揮發(fā)性成分的28.14%；異戊醇具有苦杏仁不愉快氣味。酯類物質(zhì)增加了33 種，可見固態(tài)發(fā)酵對(duì)脂類香氣成分及含量具有較大的影響，其中乙酸乙酯具有水果香味；癸酸乙酯具有椰子香、梨果香和酒香香氣；己酸乙酯具有水果香氣味；丁酸乙酯具有強(qiáng)烈的甜果香，有菠蘿、香蕉、蘋果氣息；丙酸乙酯具有菠蘿香氣味；辛酸乙酯具有菠蘿、蘋果樣的香韻和白蘭地的酒香味。烯萜類和雜環(huán)類物質(zhì)的含量較低，但對(duì)增加物質(zhì)風(fēng)味的豐富性起重要作用，2-乙基-6-甲基吡嗪具有堅(jiān)果、焙烤和甜香香氣。多酚類化合物是重要的抗氧化類化合物，在添加產(chǎn)香菌M5 后檢測(cè)到對(duì)乙烯基愈創(chuàng)木酚，具有強(qiáng)烈香辛料、丁香香氣，2，6-二叔丁基對(duì)甲酚和愈創(chuàng)木酚的香氣強(qiáng)度雖不大，但與對(duì)照相比明顯增多。

YEPD 培養(yǎng)基中檢測(cè)鑒定出45 種化合物，其中酯類10 種（11.57%）；醇類3 種（6.87%）；酸類3種（9.65%）；醛類9 種（37.86%）；酮類、酚類、烷烴類、烯烴類和雜環(huán)類共19 種，占總揮發(fā)性成分含量的17.48%。香氣成分主要為癸酸乙酯具有椰子香、梨果香氣；丁酸具有刺激性及難聞的氣味，與低級(jí)醇生成的酯類具有水果的香味；苯甲醛具有苦杏仁味；苯乙醛具有濃郁的玉簪花香氣。菌株M5 發(fā)酵YEPD 培養(yǎng)液中檢測(cè)鑒定出55 種化合物，包括：醇類6 種，占總體揮發(fā)性香氣成分的45.18%；酯類21 種（14.02%）；酸類5 種（26.4%）；醛類、酚類、烷烴類和雜環(huán)類共22 種，總計(jì)香氣揮發(fā)成分含量為11.61%。與YEPD 原液比較，醇類物質(zhì)增加了5 種，其中β-苯乙醇具有清甜玫瑰花香、茉莉花香和紫羅蘭香氣；異丁醇具有雜醇油的醇香味；異戊醇具有苦杏仁的味道。酯類增加了11 種：丙酸乙酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯具有強(qiáng)烈蘋果和菠蘿味；異丁酸乙酯具有特殊芳香味；肉豆蔻酸乙酯具有極溫和鳶尾香氣。相同的酯香成分只有一種為鄰苯二甲酸二丁酯，表明菌株M5生成的揮發(fā)性香氣成分主要為酯類和醇類。

比較菌株M5 發(fā)酵固、液培養(yǎng)基中揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵固態(tài)培養(yǎng)基中酯類化合物的種類較多，香氣濃郁。產(chǎn)玫瑰香β-苯乙醇的相對(duì)含量增加最為明顯，是代表性的香氣產(chǎn)物；酯類化合物的種類和相對(duì)含量也明顯提高。發(fā)酵YEPD 培養(yǎng)液中脂肪酸的香氣強(qiáng)度比較明顯，有濃郁的酸味，其中丁酸和2-甲基丁酸具有難聞的腳臭、汗臭味，這可能是引起后期液態(tài)發(fā)酵香氣不夠輕盈、純凈的原因。雜環(huán)類物質(zhì)的含量較低，但可能對(duì)增加物質(zhì)風(fēng)味的豐富性起重要作用[17]。

表2 菌株M5 產(chǎn)生主體香氣成分分析Table 2 Analysis of aroma components in fermentation broth of strain M5

（續(xù)表2）

2.4 菌株M5 的產(chǎn)酯能力

隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株M5 的產(chǎn)酯能力呈先升高后降低的趨勢(shì)（圖2）。菌株在發(fā)酵第6 天時(shí)液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)基產(chǎn)酯能力達(dá)到最高，為24.8g/L 和26.5 g/L（以乙酸乙酯計(jì)）。蒲春等[8]從大曲中篩選到產(chǎn)酯高的異常畢赤酵母，該酵母麩曲產(chǎn)酯能力可達(dá)到0.19 g/L。甘廣東等[22]從濃香型酒醅中分離到兩株優(yōu)勢(shì)酵母菌分別為陸生地霉（Geotrichum terrestre）和季也蒙畢赤氏酵母（Pichia guilliermondii），其產(chǎn)酯能力達(dá)到1.5，2.4 g/L。與之相比較，菌株M5 產(chǎn)酯能力高出10 倍多，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯能力。

2.5 菌株M5 的鑒定

圖2 菌株M5 的產(chǎn)酯能力Fig.2 Producing ester ability of strain M5

2.5.1 菌株M5 的菌落、菌體形態(tài)及液體培養(yǎng)特性 圖3a 和圖3b 為菌株M5 接種于YEPD 和麥芽汁固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。菌株M5 菌落呈奶油色或乳白色，中間有圓形凸起，表面不光滑，質(zhì)地油，不干燥；周圍褶皺，短絨毛狀，地毯式向四周鋪開。在YEPD 培養(yǎng)基上菌落呈同心環(huán)，在麥芽汁培養(yǎng)基上呈放射狀向四周延伸。產(chǎn)香菌M5 菌體呈磚形，節(jié)孢子單生呈長(zhǎng)筒狀或橢圓形（圖3c），可連接成鏈狀。繁殖方式以裂殖為主，無出芽細(xì)胞，大小為4.27～10.25 μm×2.78～5.62 μm。有橫隔真菌絲（圖3d），以二叉分枝的形式出現(xiàn)，無假菌絲產(chǎn)生，不產(chǎn)生子囊孢子。圖3為產(chǎn)香菌M5 的液體培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)48 h 后，發(fā)酵液澄清，液體表面有乳白色菌膜，成環(huán)沿試管壁向上生長(zhǎng)，不易碎（圖3e）。

圖3 菌株M5 的菌落、菌體形態(tài)及液體培養(yǎng)特征Fig.3 Micrographic，colony and of strain M5 and cultural characteristics in the liquid medium

2.5.2 菌株M5 的生理生化鑒定 參照巴尼特[11]的《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株M5 進(jìn)行了生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

2.5.3 分子生物學(xué)鑒定 以菌株M5 的總DNA為模板，NL1 和NL4 為引物，擴(kuò)增菌株M5 的26S rDNA 近5'端的D1/D2 序列并測(cè)序。將序列登陸http：//www.genbank.com 進(jìn)行BLAST 比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見表4。由表4可知，菌株M5 與地霉屬白地霉具有很高的序列相似性，達(dá)到99%。以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株為外群，使用MEGA5.1 軟件，通過多序列比對(duì)，以鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明菌株M5 與地霉屬白地霉（G.candidum）的親緣關(guān)系最近（圖4）。

綜合菌株M5 的菌落、菌體特征、培養(yǎng)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將其確定為白地霉（G.candidum），命名為白地霉M5。

表3 菌株M5 的生理生化特性Table3 The physiological and biochemistry characteristics of strain M5

表4 菌株M5 測(cè)序結(jié)果比對(duì)Table 4 The results on sequence alignment of strain M5

圖4 菌株M5 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain M5

2.6 菌株M5 的生長(zhǎng)與產(chǎn)酯量的關(guān)系

圖5 菌株M5 的生長(zhǎng)與產(chǎn)酯量的關(guān)系Fig.5 The relation on growth of strain M5 and ester quantity producting by strain M5

由圖5可知，培養(yǎng)時(shí)間為0～18 h，OD600值增長(zhǎng)緩慢，表明菌株M5 生長(zhǎng)處于延滯期，此時(shí)總酯含量增長(zhǎng)也較緩慢，發(fā)酵液釋放淡淡的果香；發(fā)酵時(shí)間為18～69 h 時(shí)，OD600值指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，表明菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，總酯含量增長(zhǎng)較快；此時(shí)發(fā)酵液釋放令人愉快的果香、花香和巧克力味香氣；發(fā)酵時(shí)間在69 h 以后，OD600值逐漸降低，表明菌株M5開始進(jìn)入衰亡期，此時(shí)酯含量還在增長(zhǎng)，但是發(fā)酵液釋放的香氣較復(fù)雜，有臭雞蛋的味道。以上結(jié)果表明，菌體的產(chǎn)酯能力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，令人愉悅的香味物質(zhì)主要產(chǎn)生于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；不良的氣味可能是由于菌株的衰亡而引起的。

2.7 菌株M5 的耐受性

2.7.1 酸堿耐受性 由圖6可知，當(dāng)pH 2 時(shí)，OD600值幾乎為零，表明該菌株具有較強(qiáng)的耐酸性能，最低酸耐受pH 為3；隨著pH 的增大，OD600值先增大后降低，表明菌株生物量呈先上升后下降的趨勢(shì)，菌株生長(zhǎng)最適pH 為4；當(dāng)pH 達(dá)到7 以上時(shí)，OD600值幾乎為零，表明菌株完全不再生長(zhǎng)，菌株最高耐受pH 值為6。該菌株具有較低的堿耐受性。

2.7.2 糖耐受性 由圖7可知，隨著糖度的升高，OD600值先升高后降低，表明菌株生物量先升高，后降低，當(dāng)糖度為10%時(shí)，菌株生長(zhǎng)最旺盛，后隨著糖濃度的增加而降低，菌株生長(zhǎng)的速率變緩；當(dāng)糖度達(dá)到40%時(shí)，菌株不再生長(zhǎng)，由此可見，菌株M5 最高耐受糖度為35%，最適生長(zhǎng)糖度為10%。

圖6 菌株M5 耐酸堿性Fig.6 Acidity and alkaline tolerance of strain M5

圖7 菌株M5 耐糖性Fig.7 Glucose tolerance of strain M5

2.7.3 酒精耐受性 由圖8可知，隨著酒精度的升高，OD600值逐漸降低，表明隨著酒精體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，菌株M5 生長(zhǎng)逐漸受到影響，菌株適合在酒精度低的條件下生長(zhǎng)繁殖。當(dāng)酒精度達(dá)到21%時(shí)，OD600值趨于零，表明菌株的生長(zhǎng)完全受到抑制，菌株M5 最高耐酒精度為18%。

2.7.4 溫度耐受性 由圖9可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，OD600值逐漸降低，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，OD600值趨于零，表明菌株M5 在25 ℃的條件下生長(zhǎng)較旺盛，隨著溫度的不斷升高，菌株的生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)速率變緩，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，菌株完全不生長(zhǎng)。菌株最高耐受溫度為40 ℃。

3 結(jié)論

圖8 菌株M5 耐酒精性Fig.8 Ethanol tolerance of strain M5

圖9 菌株M5 耐溫度性Fig.9 Temperature tolerance of strain M5

通過嗅聞技術(shù)和HS-SPME-GC-MS 檢測(cè)技術(shù)，從清香型白酒的新鮮酒醅中分離、篩選獲得一株能夠產(chǎn)生愉悅水果香氣的菌株M5，該菌株在糖化酶和高粱組合固體培養(yǎng)基上發(fā)酵，產(chǎn)生果香味，清香味，并夾雜奶香味，香氣最佳，主要的香氣物質(zhì)為酯類和醇類，其中產(chǎn)玫瑰花香的B-苯乙醇占到了香氣物質(zhì)的28.14%，產(chǎn)酯能力高達(dá)26.5g/L。通過形態(tài)學(xué)，生理生化試驗(yàn)和26S rDNA 序列分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株屬于地霉屬的白地霉 （G.candidum），命名為白地霉M5。菌株M5 對(duì)環(huán)境具有一定的耐受性，可以在pH 3～6、酒精度0%～18%、糖度5%～35%、溫度25～40 ℃條件下生長(zhǎng)代謝，最適生長(zhǎng)糖度為10%，pH 4。本研究將為清香型白酒及風(fēng)味導(dǎo)向的中國(guó)白酒發(fā)酵調(diào)控提供理論基礎(chǔ)及優(yōu)質(zhì)菌種資源。